MicroARN - Effet papillon de Wuhan Inc.

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 184 (2023) Citer cet article

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La schistosomiase est une maladie parasitaire grave mais négligée chez l'homme qui peut entraîner une fibrose hépatique et la mort. Les cellules étoilées hépatiques activées (CSH) sont les principaux effecteurs qui favorisent l'accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la fibrose hépatique. L'expression aberrante du microARN-29 est impliquée dans le développement de maladies fibrotiques. Cependant, on en sait moins sur le rôle de miR-29 dans la fibrose hépatique induite par Schistosoma japonicum (S. japonicum).

Les niveaux de microARN-29a-3p (miR-29a-3p) et de l'homologue Roundabout 1 (Robo1) ont été examinés dans les tissus hépatiques lors d'une infection à S. japonicum. L'implication possible de la voie de signalisation miR-29a-3p-Robo1 a été déterminée. Nous avons utilisé des souris knock-in conditionnelles MIR29A et des souris injectées avec un agomir miR-29a-3p pour étudier le rôle de miR-29a-3p dans la fibrose hépatique induite par la schistosomiase. Les contributions fonctionnelles de la signalisation miR-29a-3p-Robo1 dans la fibrose hépatique et l'activation des HSC ont été étudiées à l'aide de HSC primaires de souris et de la lignée cellulaire HSC humaine LX-2.

MiR-29a-3p était régulé à la baisse chez les humains et les souris atteints de fibrose induite par le schistosome, et Robo1 était régulé à la hausse dans les tissus hépatiques. Le miR-29a-3p a ciblé Robo1 et a régulé négativement son expression. De plus, le niveau d'expression de miR-29a-3p chez les patients atteints de schistosomiase était fortement corrélé au diamètre de l'épaisseur de la veine porte et de la rate, qui représentent la sévérité de la fibrose. De plus, nous avons démontré qu'une élévation efficace et soutenue de miR-29a-3p inversait la fibrose hépatique induite par le schistosome. Notamment, nous avons montré que miR-29a-3p ciblait Robo1 dans les HSC pour empêcher l'activation des HSC lors de l'infection.

Nos résultats fournissent des preuves expérimentales et cliniques que la voie de signalisation miR-29a-3p-Robo1 dans les CSH joue un rôle important dans le développement de la fibrose hépatique. Par conséquent, notre étude met en évidence le potentiel de miR-29a-3p en tant qu'intervention thérapeutique pour la schistosomiase et d'autres maladies fibrotiques.

La schistosomiase est l'une des maladies infectieuses tropicales les plus répandues, mais les plus négligées, et elle touche plus de 230 millions de personnes dans 78 pays, y compris des enfants et de jeunes adultes [1]. Les deux espèces les plus importantes qui causent des maladies du foie chez l'homme sont Schistosoma mansoni et Schistosoma japonicum (S. japonicum) [2]. La pathologie principale de la schistosomiase induite par S. japonicum est la formation de granulomes et la fibrose induits par les œufs. Les vers adultes femelles vivant dans les veines mésentériques de l'hôte pondent de nombreux œufs, dont la plupart sont piégés dans le tissu hépatique via le système veineux porte, provoquant une réaction granulomateuse et une fibrose [3]. La fibrose hépatique et l'hypertension portale qui en résulte sont les principales causes de mortalité associées à cette maladie chronique [4]. Élucider les mécanismes qui entraînent la fibrose hépatique peut conduire à des stratégies d'intervention plus efficaces pour la schistosomiase et une variété de maladies fibrotiques.

Les cellules étoilées hépatiques (CSH) sont les principaux effecteurs de différents types de fibrose hépatique [5], dont la fibrose hépatique induite par une infection schistosomienne [6]. Les CSH quiescentes sont des cellules périsinusoïdales résidentes situées dans l'espace sous-endothélial entre les hépatocytes et les cellules endothéliales sinusoïdales, et ces cellules sont caractérisées par la présence de gouttelettes cytoplasmiques de vitamine A [7]. Lors de l'activation, les CSH se transforment progressivement en myofibroblastes prolifératifs, contractiles et fibrogéniques [8]. Les lésions hépatiques stimulent une variété de cytokines et de facteurs de croissance qui activent les CSH pour produire de l'actine musculaire lisse (α-SMA) et sécréter un excès de matrice extracellulaire (ECM), ce qui entraîne une fibrose hépatique [9, 10]. Il a été montré que l'infection par les schistosomes active les CSH réparties à la périphérie des granulomes induits par les œufs [11]. Des études antérieures ont suggéré que le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1) était la cytokine effectrice de la fibrose hépatique induite par les schistosomes, et il reste la cytokine fibrogène classique conduisant à l'activation des CSH [12, 13, 14]. Le blocage de l'activation des CSH est devenu l'une des stratégies majeures des interventions thérapeutiques pour la fibrose hépatique [15].

Les microARN (miARN) sont de petits ARN endogènes non codants qui régulent négativement l'expression des gènes par appariement de bases avec la région non traduite en 3 'de leur ARN messager cible (ARNm) [16, 17]. De plus en plus de preuves ont démontré que les miARN jouent un rôle important dans le maintien de l'homéostasie cellulaire dans des conditions normales et pathologiques [18]. La dérégulation de l'expression des miARN est impliquée dans la fibrose dans plusieurs systèmes d'organes, y compris le système vasculaire (fibrose pulmonaire), le foie et les reins [19,20,21,22]. Plusieurs études ont montré que les miARN jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de la fibrose hépatique et peuvent être des cibles thérapeutiques utiles [23, 24]. Nos découvertes précédentes indiquaient qu'une expression accrue de miR-182 favorisait l'activation des HSC en ciblant FOXO1, ce qui entraînait l'induction d'une fibrose hépatique [25]. La famille miR-29 se compose de miR-29a, miR-29b et miR-29c, qui ont été significativement diminués dans les foies fibrotiques, comme démontré dans la fibrose hépatique humaine et deux modèles différents de lésions hépatiques induites par la ligature des voies biliaires (BDL) et tétrachlorure de carbone (CCl4) [22, 26, 27]. Cependant, il n'y a aucune preuve expérimentale pour démontrer que miR-29a est impliqué dans l'apparition ou la progression de la fibrose hépatique induite par l'infection à schistosomes.

L'homologue rond-point 1 (Robo1) est un membre de la famille moléculaire des récepteurs d'adhésion cellulaire neurale et il est exprimé dans divers types de cellules [28, 29]. Robo1 est un régulateur essentiel dans de multiples processus biologiques, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation et la migration [30, 31]. Robo1 est lié à plusieurs types de cancer [32, 33] et de maladies chroniques, notamment les maladies rénales [34] et la fibrose hépatique [35]. Nos résultats précédents indiquaient que le microARN-29a-3p (miR-29a-3p) réduisait l'expression de Robo1 pour inhiber la prolifération, la migration, l'invasion, la progression tumorale et les métastases des cellules de carcinome hépatocellulaire [36]. À la lumière de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse que miR-29a-3p et Robo1 étaient impliqués de manière critique dans la fibrose hépatique induite par la schistosomiase. La présente étude a utilisé S. japonicum chez l'homme et la souris pour étudier le rôle de miR-29a-3p et Robo1. Nous avons utilisé des souris knock-in conditionnelles MIR29A et des souris injectées avec un agomir miR-29a-3p pour étudier notre hypothèse et élucider les voies de pathogenèse moléculaire de miR-29a-3p et Robo1 dans les modifications fibrotiques des foies humains et de souris lors de l'exposition au schistosome. infection.

Des échantillons de biopsie hépatique ont été prélevés à l'hôpital Tongji, Tongji Medical College, Université des sciences et technologies de Huazhong, entre septembre 2015 et août 2019. Des échantillons de biopsie en coin de parties normales du foie ont été obtenus chez sept patients sans carcinome hépatique métastatique (3 carcinomes coliques et 4 carcinomes gastriques) comme témoins. Des échantillons de foie fibrotique ont été prélevés chez neuf patients atteints de schistosomiase chronique. L'état pathologique des tissus a été confirmé par un diagnostic histopathologique. Les critères d'exclusion de l'étude étaient les patients atteints d'autres types d'hépatite et de maladie du foie associés à la consommation de drogue ou d'alcool. Sauf indication contraire, les valeurs n se réfèrent au nombre de patients dont le tissu a été obtenu. En raison du nombre limité d'échantillons de tissus, tous les échantillons n'ont pas été inclus dans chaque protocole d'étude. Les caractéristiques démographiques des patients inclus sont résumées dans le tableau 1.

La génération de la lignée de souris knock-in conditionnelle MIR29A humaine par CRISPR/Cas9 a été sous-traitée à Cyagen Biosciences (Suzhou, Chine). Les souris ont été créées sur le fond génétique C57BL/6J. L'ARNg (5′-GAACACTAGTGCACTTATCCTGG-3′) au locus Hipp11 (H11), le vecteur donneur contenant la cassette "CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA" et l'ARNm Cas9 ont été co-injectés dans la souris fécondée oeufs pour générer une progéniture knock-in conditionnelle ciblée. Une représentation schématique de la stratégie de ciblage est présentée dans le fichier supplémentaire 1 : Fig. S1.

Des souris femelles âgées de six semaines ont été utilisées dans cette étude. Des souris C57BL/6J de type sauvage (WT) ont été obtenues auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine). Des souris knock-in conditionnelles MIR29A humaines ont été construites par Cyagen. Tous les animaux ont été hébergés dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes avec de la nourriture et de l'eau de laboratoire standard disponibles ad libitum. Pour induire l'infection, sept souris femelles MIR29A âgées de 6 semaines et sept souris femelles WT C57BL/6J du même âge ont été exposées par voie percutanée à 16 ± 1 cercaires de S. japonicum (souche de Chine continentale) obtenues à partir d'escargots Oncomelania hupensis infectés achetés à l'Institut de Nanjing de la prévention et du contrôle de la schistosomiase (Nanjing, Chine). Sept souris non infectées appariées selon l'âge et le sexe ont été utilisées comme témoins.

Pour déterminer si miR-29a-3p était suffisant pour inverser la fibrose hépatique induite par les œufs, un agomir miR-29a-3p (RiboBio, Guangzhou, Chine) a été utilisé. L'agomir miR-29a-3p et l'agomir témoin négatif (NC) ont été dissous dans une solution saline tampon phosphate (PBS) conformément aux instructions du fabricant et dilués dans du PBS jusqu'à une concentration finale du bain de 10 nmol/500 μl. Les souris infectées ont été traitées par voie orale avec 300 mg/kg de praziquantel pendant 2 jours consécutifs pour tuer les parasites à 6 semaines post-infection, et les souris ont reçu l'agomir miR-29a-3p ou l'agomir NC à une dose de 10 nmol par souris ou 500 ul de PBS via la veine caudale tous les 4 jours pendant 28 jours. Les souris ont été récoltées 10 semaines après l'infection pour une analyse plus approfondie.

Pour estimer la charge en œufs, 0,2 g de chaque foie a été digéré pendant une nuit avec 20 ml d'hydroxyde de potassium à 4 % et le nombre d'œufs a été compté au microscope. Le nombre total d'œufs par gramme dans le foie a été calculé à l'aide de la formule suivante : le nombre d'œufs calculé × 5. L'indice du foie ou de la rate a été calculé à l'aide de la formule suivante : (poids total du foie ou de la rate de souris/poids total du corps de la souris) × 100 % [12, 37, 38]. La taille des granulomes d'œufs a été mesurée dans les sections H&E de Mayer à l'aide d'un oculaire de mesure calibré, et l'étendue de la fibrose a été évaluée par la coloration au trichrome de Masson des sections, comme décrit précédemment [12]. Le score de fibrose total a été déterminé en multipliant la densité et la surface de chaque granulome (pour un score maximum de 16). La teneur en hydroxyproline dans le foie a été détectée à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique selon les instructions du fabricant (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine).

Environ 1 ml de sang a été prélevé sur des souris par extirpation du globe oculaire. Le sang a été incubé pendant 4 h à température ambiante pour permettre la formation de caillots, puis centrifugé (3500 tr/min, 10 min) pour séparer le sérum du caillot. Les taux sériques d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) ont été mesurés à l'aide d'un analyseur automatique Siemens Advia 1650.

Le foie a été initialement digéré in situ avec 0,05 % de collagénase de type IV à 37 °C avec agitation du bain pendant 30 min. Les hépatocytes ont été isolés par centrifugation de la suspension cellulaire résultante à 50 xg pendant 3 min et purifiés par centrifugation à 50 xg pendant 2 min. Après avoir culotté les hépatocytes, le surnageant contenant les cellules non parenchymateuses a été centrifugé à 450 xg pendant 8 min. Les CSH ont été isolées à partir de cellules non parenchymateuses à l'aide d'un gradient d'iodixanol de 15 % (p/v) et 11,5 % (p/v) (OptiPrep ; Stemcell Technologies, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada) à 1 450 x g pendant 20 min. Pour purifier davantage les CSH, nous avons appauvri les CSH de cellules de Kupffer (KC) à l'aide d'un anticorps anti-CD271 conjugué à la biotine (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne) et de microbilles anti-biotine (Miltenyi Biotec). La pureté était > 97 % et la viabilité était > 95 %. Les résultats représentatifs de la purification des HSC sont présentés dans le fichier supplémentaire 2 : Fig. S2.

LX-2 est une lignée cellulaire bien caractérisée dérivée de HSC humaines, et ces cellules ont été acquises auprès du Cell Collection Center de l'Université de Wuhan (Chine). Les CSH primaires et les cellules LX-2 ont été ensemencées dans des plaques en plastique et cultivées dans du DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Gibco, Gaithersburg, MD, USA) et de 100 μg/ml de pénicilline/ streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les cultures cellulaires ont été maintenues à 37°C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2.

Des cellules LX-2 (2, 5 × 105 cellules / puits) ont été étalées dans des plaques à six puits avec ou sans la présence de TGF-β1 recombinant (PeproTech). Pour déterminer les effets de miR-29a-3p in vitro, des cellules LX-2 ont été transfectées avec hsa-miR-29a-3p exogène (miRBase : MIMAT0000086). Les cellules ont été transfectées avec des mimiques miR-29a-3p 50 nM, des inhibiteurs miR-29a-3p 100 nM ou leurs contrôles négatifs à l'aide d'un kit de transfection riboFECT™ CP (RiboBio, Guangzhou, Chine) comme décrit précédemment [39]. En bref, 10 x de tampon riboFECT™ CP ont été dilués à 1 x. Le système de transfection était le mélange de tampon 1 × riboFECT™ CP, de réactif riboFECT™ CP et d'imitateurs (50 nM) ou d'inhibiteurs (100 nM), et le mélange a été transfecté dans des cellules LX-2 ; 48 h après la transfection, les cellules de chaque groupe expérimental ont été remises en suspension, collectées et soumises à des expériences en aval.

Des échantillons de foie humain et de souris ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h, inclus dans de la paraffine et coupés en sections de 4 µm d'épaisseur. Pour l'immunohistochimie, des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (PeproTech Inc., États-Unis) ont été utilisés pour l'immunocoloration avec les anticorps primaires suivants : lapin polyclonal anti-Robo1 (1:50, ab7279, Abcam, Cambridge, MA, États-Unis), anti-collagène I polyclonal de lapin (1:100, 14695-1-AP, ProteinTech, Chicago, IL, USA) et anti-α-SMA monoclonal de lapin (1:500, ab108424, Abcam). Pour la coloration par immunofluorescence, des coupes de tissus ont été incubées avec des anticorps primaires contre Robo1 (1:50, ab7279, Abcam), α-SMA (1:200, BM0002, Boster Biological Technology, Wuhan, Chine) et desmine (1:100, ab227651 , Abcam), suivie d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 594 et Alexa Fluor 488 (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Toutes les coupes ont été colorées avec 1 μg/ml de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; Sigma-Aldrich) pour visualiser les noyaux cellulaires. Au moins trois sections de foie ont été incluses dans chaque groupe. Les sections colorées ont été visualisées au microscope (Nikon Eclipse Ci) et les images ont été capturées à l'aide d'un appareil photo numérique haute résolution (viseur numérique Nikon DS-FI2).

L'ARN total a été isolé à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. La réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée comme décrit précédemment [40]. Les niveaux d'expression de Robo1, Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 ont été déterminés à l'aide du kit SYBR Green Master Mix (Takara, Kusatsu, Japon). Le niveau d'expression de miR-29a-3p a été déterminé avec un kit de démarrage Bulge-Loop miRNA qRT-PCR (RiboBio, Guangzhou, Chine) selon le protocole du fabricant. Des amorces spécifiques à la séquence pour U6 et miR-29a-3p ont été synthétisées par RiboBio (Guangzhou, Chine). Les témoins endogènes de cette étude étaient le snRNA U6 et le GAPDH, et la méthode 2−ΔΔCt a été utilisée pour calculer le facteur de variation de l'expression de tous les ARNm et de miR-29a-3p. Les séquences d'amorces humaines et de souris sont présentées dans le tableau 2.

La protéine cellulaire totale a été extraite sur de la glace avec un tampon de lyse RIPA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) en présence d'inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés (Boster Biological Technology, Wuhan, Chine) et quantifiée par dosage BCA (Pierce, Cramlington, Royaume-Uni). Un total de 30 μg / piste d'extrait protéique a été séparé via 10% PAGE (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine), suivi d'un transfert sur une membrane PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). La liaison non spécifique a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % dans du TBST. La membrane a été incubée avec un anti-Robo1 de lapin (1:1000, ab7279, Abcam, Cambridge, MA) pendant une nuit à 4 °C. Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires anti-lapin conjugués à la HRP et détectées à l'aide d'une chimiluminescence améliorée (ECL; Abbkine, Redlands, CA, USA). L'anti-GAPDH de lapin (1:2000, 10494-1-AP, ProteinTech, Chicago, USA) a été utilisé comme standard interne. La densitométrie a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ.

Les résultats expérimentaux sont exprimés en moyenne ± écart type (SD). La signification statistique entre les groupes expérimentaux a été évaluée à l'aide du test t de Student bilatéral et de l'ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey. Les résultats cliniques des patients sont exprimés en médiane et en écart interquartile. En raison des distributions asymétriques de la plupart des variables des patients, le test U de Mann-Whitney et le post-test de Kruskal-Wallis avec comparaisons multiples de Dunn ont été appliqués. Pour les données catégorielles, le test χ2 ou le test exact de Fisher a été effectué pour déterminer les différences entre les groupes. Le test de classement de Spearman a été utilisé pour les corrélations. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées avec GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) ou SPSS 25.0 (SPSS, Chicago, IL). Les valeurs P < 0,05 ont été considérées comme significatives.

Pour examiner l'expression de miR-29a-3p et Robo1 dans des échantillons de foie, une biopsie hépatique a été réalisée chez des patients atteints de schistosomiase chronique et des patients témoins. Les tissus hépatiques fibrotiques avaient des zones fibrotiques plus grandes et plus de dépôt de collagène, et des œufs de S. japonicum ont été observés dans les coupes d'échantillons de foie de patients atteints de schistosomiase (Fig. 1A). Le niveau de miR-29a-3p dans le groupe fibrotique était significativement inférieur à celui du groupe témoin et le niveau d'ARNm de Robo1 a augmenté (Fig. 1B, C). Les immunoblots ont été analysés et le niveau de transcription de Robo1 a été confirmé (Fig. 1D, E). Pour évaluer davantage les effets fonctionnels de Robo1, nous avons analysé Robo1 dans les tissus hépatiques par immunohistochimie. Les tissus fibrotiques présentaient une coloration Robo1 plus forte que les tissus hépatiques témoins, et les cellules Robo1-positives étaient principalement localisées dans les zones d'inflammation et de fibrose (Fig. 1F). La coloration par immunofluorescence a été utilisée pour détecter l'expression de Robo1 et la présence de CSH, qui sont les principales cellules effectrices dans divers types de fibrose hépatique et jouent un rôle important dans la liaison de l'inflammation hépatique à la fibrogenèse. La colocalisation de Robo1 et des CSH a été observée, en particulier dans le foie de patients atteints de schistosomiase (Fig. 1F). De plus, nous avons trouvé des corrélations significatives entre les niveaux de miR-29a-3p et Robo1 et le diamètre de la veine porte et l'épaisseur de la rate chez les patients atteints de schistosomiase (Fig. 1G – J). Ces données suggèrent que miR-29a-3p et Robo1 pourraient être impliqués dans la progression de la fibrose hépatique induite par les schistosomes.

Diminution de l'expression de miR-29a-3p et augmentation de l'expression de Robo1 dans les tissus hépatiques de patients atteints de schistosomiase. A Des coupes de tissus hépatiques de patients incluses dans la paraffine ont été colorées avec du H&E, du trichrome de Masson et du rouge Sirius. Barre d'échelle, 200 μm. B, C L'ARN total a été extrait pour l'analyse qPCR des niveaux d'expression miR-29a-3p et Robo1. Témoin (n = 7), fibrose (n = 9). D, E L'expression de Robo1 a été déterminée par western blot. La densité d'image a été quantifiée à l'aide d'ImageJ et normalisée à GAPDH. F Une coloration immunohistochimique représentative de Robo1 et une coloration par immunofluorescence de la colocalisation de Robo1 (vert) avec α-SMA (rouge) dans des coupes de foie ont été détectées. Les flèches jaunes indiquent les cellules positives. Barre d'échelle, 50 μm. G – J Corrélations entre les niveaux d'ARNm de miR-29a-3p et Robo1 et le diamètre de la veine porte et l'épaisseur de la rate chez les patients atteints de schistosomiase (n = 9). I Le plus gros point montre les données de deux patients. Les données sont présentées sous forme de médiane et d'intervalle interquartile (B, C et E). Toutes les données sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes. La signification a été calculée à l'aide du test U de Mann-Whitney (B, C et E) ou du test du rang de Spearman (G–J). *P < 0,05, ***P < 0,001. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1

Des échantillons de foie de souris à divers moments après l'infection par S. japonicum ont été prélevés. Robo1 est une cible potentielle de miR-29a-3p, comme le prédit la base de données TargetScan (www.targetscan.org). Pour analyser la relation entre miR-29a-3p et Robo1, nous avons évalué leur expression au cours de la progression de la schistosomiase hépatique. Nous avons constaté que l'expression de miR-29a-3p commençait à diminuer dans le foie 6 semaines après l'infection et atteignait ses niveaux les plus bas aux semaines 8 et 12 (Fig. 2A). En revanche, le niveau d'expression de Robo1 était significativement élevé 8 semaines après l'infection (Fig. 2B – D). De plus, la régulation négative de miR-29a-3p a été principalement observée dans les hépatocytes isolés et les CSH de souris infectées (Fig. 2E). Nous avons également analysé l'expression relative de miR-29a-3p dans différents types de cellules hépatiques par qPCR et avons constaté que miR-29a-3p était principalement présent dans les HSC primaires isolées plutôt que dans les hépatocytes ou les KC de foies non infectés. Le niveau d'expression de miR-29a-3p était significativement régulé à la baisse dans les CSH de foies infectés par rapport aux hépatocytes et aux KC (Fig. 2F). Nous avons également effectué une coloration immunochimique pour Robo1 et observé que les cellules productrices de Robo1 étaient principalement situées à la périphérie des granulomes d'œufs (Fig. 2G). La double coloration par immunofluorescence a révélé la colocalisation de Robo1 et de α-SMA (Fig. 2G), indiquant que les CSH activées exprimaient Robo1 in vivo. L'expression de miR-29-3p dans les HSC a commencé à diminuer 6 semaines après l'infection, mais le niveau d'ARNm de Robo1 a augmenté à ce moment (Fig. 2H, I). De plus, une corrélation négative a été observée entre miR-29a-3p et l'expression de Robo1 par l'analyse de corrélation de Spearman (R = - 0, 8301, P <0, 0001; Fig. 2J). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les HSC activés dans les foies infectés sont une source de Robo1, et que Robo1 est une cible potentielle de miR-29a-3p dans les HSC.

Analyse de l'expression de miR-29a-3p et Robo1 dans la schistosomiase murine. A, B L'expression de miR-29a-3p et Robo1 dans des échantillons de foie pendant l'infection a été détectée par qPCR (n = 4–5). La protéine C, D Robo1 a été déterminée par Western blot, quantifiée à l'aide d'ImageJ et normalisée à GAPDH (n = 6). E, F Des hépatocytes primaires (Heps), des cellules de Kupffer (KC) et des cellules étoilées hépatiques (HSC) ont été isolés à partir de foies non infectés et infectés (8 semaines après l'infection), et le niveau de miR-29-3p a été déterminé par qPCR (n = 3). G Une coloration immunohistochimique représentative de Robo1 et une coloration par immunofluorescence de la colocalisation de Robo1 (vert) avec α-SMA (rouge) dans des coupes de foie ont été détectées. Les flèches jaunes indiquent les cellules positives. Barre d'échelle, 50 μm. H, I Les CSH primaires ont été isolées des tissus hépatiques et l'expression de miR-29a-3p et Robo1 dans les CSH a été détectée par qPCR (n = 4). J Corrélations entre les niveaux d'ARNm de Robo1 et miR-29a-3p dans les CSH de souris (n = 20). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD de deux expériences indépendantes. La signification a été déterminée par le test t de Student bilatéral (A, B, D, E, H et I) ou ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (F) ou le test de rang de Spearman (J). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, par rapport aux échantillons 0W (A, B, D, H et I) . miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1 ; Heps : hépatocytes ; KC : cellules de Kupffer ; CSH : cellules étoilées hépatiques ; ns : non significatif

Notre étude précédente a utilisé un test de gène rapporteur à double luciférase pour démontrer que Robo1 était une cible directe de miR-29a-3p [36]. La présente étude a montré que la stimulation des cellules LX-2 avec le TGF-β1, qui est un gène profibrotique typique dans la progression de la fibrose hépatique, réduisait l'expression de l'ARNm de miR-29a-3p et régulait à la hausse le niveau d'ARNm de Robo1 (Fig. 3A , B). De plus, nous avons transfecté des imitateurs ou des inhibiteurs de miR-29a-3p dans des cellules LX-2 et quantifié les niveaux de miR-29a-3p et de Robo1 par qPCR et Western blot. Comme prévu, miR-29a-3p était élevé dans le groupe miR-imitateur et réduit dans le groupe miR-inhibiteur (Fig. 3C). Aux niveaux de l'ARNm et des protéines, l'élévation de miR-29a-3p a nettement réduit l'expression de Robo1, et l'épuisement de miR-29a-3p a augmenté de manière significative l'expression de Robo1 (Fig. 3D – F). Prises ensemble, ces données indiquent que Robo1 est une cible directe de miR-29a-3p dans les HSC.

Validation de la relation entre miR-29a-3p et Robo1. Les cellules A, B LX-2 ont été exposées à 10 ng/ml de TGF-β1 pendant 48 h, et l'expression de miR-29a-3p et Robo1 a été détectée par qPCR (n = 3). Les cellules C – F LX-2 ont été cultivées sur une plaque en plastique et transfectées avec des mimiques miR-29a-3p 50 nM, des inhibiteurs miR-29a-3p 100 nM ou leurs témoins négatifs (NC) pendant 48 h. L'expression de miR-29a-3p et Robo1 a été déterminée par qPCR (n = 3) (C, D) et western blot (n = 3–4) (E, F). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET. Toutes les données sont représentatives d'au moins trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par le test t de Student bilatéral (A–D, F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1

Pour évaluer les effets de la signalisation miR-29a-3p-Robo1 sur la pathogenèse de la fibrose hépatique, nous avons établi un modèle de fibrogenèse hépatique induite par S. japonicum chez des souris knock-in conditionnelles MIR29A humaines. Les souris WT ont subi le même traitement que les témoins. Par rapport aux souris WT, les souris MIR29A ont montré un niveau plus élevé de miR-29a-3p dans le cœur (environ 2,0 fois), le foie (environ 1,8 fois), la rate (environ 3,2 fois) et les reins (environ 2,2 fois). ) (Fichier complémentaire 3 : Fig. S3). Les changements morphologiques dans les échantillons de foie et de rate ont montré une réponse granulomateuse modérée et une splénomégalie chez les souris MIR29A infectées par S. japonicum par rapport aux souris WT infectées (Fig. 4A). Ces résultats ont été confirmés par les niveaux réduits d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) dans le sérum de souris et confirmés par les indices du foie et de la rate (Fig. 4B – E). Notamment, les souris MIR29A infectées par S. japonicum ont présenté une réduction significative des dépôts d'ECM, comme le montre la quantification de l'hydroxyproline (Fig. 4F), la coloration au trichrome de Masson et la coloration au rouge Sirius (Fig. 4A, G et H), et une nette réduction de la taille des granulomes hépatiques telle que visualisée par la coloration H&E (Fig. 4A, I). Une réduction de la fibrose a été confirmée par la coloration immunohistochimique et la quantification basée sur la qPCR de l'expression des gènes associés à la fibrose dans le foie des souris infectées. La coloration immunohistochimique du collagène I et de l'α-SMA et les quantités d'ARNm Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 ont été nettement réduites chez les souris MIR29A infectées par S. japonicum par rapport aux souris WT infectées (Fig. 4A, J -M). Cependant, il n'y a pas eu de changement significatif dans la charge en œufs entre les deux groupes infectés, ce qui indique que le traitement au miR-29a n'a eu aucun effet sur la reproduction et la survie du parasite (Fichier supplémentaire 4 : Fig. S4A).

Les souris MIR29A ont développé des lésions hépatiques et une fibrose moins facilement pendant l'infection par le schistosome. Des souris MIR29A et des souris WT ont été infectées par voie percutanée avec 16 cercaires de Schistosoma japonicum ou sont restées non infectées. Des échantillons de foie et de rate ont été prélevés 10 semaines après l'infection. Une macrographie de foies et de rates de souris MIR29A et de souris WT dans les groupes non infectés et infectés. Barre d'échelle, 1 cm. Coloration H&E, trichrome de Masson et rouge Sirius de coupes de foie et coloration immunohistochimique pour le collagène I et α-SMA. Barre d'échelle, 50 μm. B, C Les indices du foie et de la rate ont été déterminés (n = 7). D, E Les taux sériques d'ALT et d'AST ont été mesurés (n = 7). F Teneur en collagène dans les foies déterminée par la teneur en hydroxyproline (n = 7). G Scores de fibrose mesurés à partir de la coloration au trichrome de Masson des coupes de foie (n = 7). H Les zones positives pour la coloration au rouge Sirius ont été mesurées à l'aide du logiciel IPP (n = 7). I La taille du granulome a été mesurée à partir de coupes de foie colorées à l'H&E (n = 7). J–M L'expression de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 dans le foie au cours de l'infection a été détectée par qPCR (n = 7). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. Des comparaisons multiples ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (BM). **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, par rapport aux échantillons WT infectés. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1 ; ALT : alanine aminotransférase ; AST : aspartate aminotransférase

Nous avons ensuite évalué le niveau de Robo1 chez ces souris. L'expression de l'ARNm de Robo1 était significativement plus faible dans les tissus hépatiques des souris MIR29A que chez les souris WT dans les groupes non infectés et infectés (Fig. 5A). La protéine Robo1 a diminué dans les tissus hépatiques des souris MIR29A infectées par S. japonicum par rapport aux souris WT infectées, comme déterminé par Western blot. Bien que le groupe de souris MIR29A non infectées ait présenté une légère réduction de l'expression de Robo1 par rapport au groupe de souris WT non infectées, la différence n'était pas statistiquement significative (Fig. 5B, C). Nous avons ensuite étudié si la surexpression de miR-29a empêchait l'activation des HSC induite par la schistosomiase. Nous avons isolé les HSC primaires de souris et avons constaté que les HSC dans les tissus hépatiques de souris infectés exprimaient Robo1 in vivo sur la base de la coloration par immunofluorescence. De plus, l'intensité de fluorescence de Robo1 était diminuée chez les souris MIR29A infectées par rapport aux souris WT infectées (Fig. 5D). Les quantités d'ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 ont été nettement réduites dans les CSH infectées de souris MIR29A par rapport aux souris WT (Fig. 5E – H). Ces résultats suggèrent que la surexpression de miR-29a réduit l'expression de Robo1 et empêche l'activation des HSC induite par la schistosomiase.

Les souris MIR29A étaient mieux à même de prévenir l'activation des HSC lors d'une infection par le schistosome. A Le niveau d'expression de Robo1 dans les foies a été déterminé par qPCR (n = 7). La protéine B, C Robo1 a été déterminée par Western blot, quantifiée à l'aide d'ImageJ et normalisée à GAPDH (n = 6). D – H Les CSH primaires ont été isolées des tissus hépatiques de souris. D Une coloration par immunofluorescence représentative de la colocalisation de Robo1 (vert) avec α-SMA (rouge) dans les HSC primaires a été détectée. Les encarts montrent un grossissement plus élevé de la zone délimitée. Barre d'échelle, 50 μm. E – H L'expression de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 dans les CSH primaires au cours de l'infection a été détectée par qPCR (n = 7). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD de deux expériences indépendantes. La signification a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (A, C, E–H). ##P < 0,01, par rapport aux échantillons WT non infectés. ** P < 0,01, **** P < 0,0001, par rapport aux échantillons WT infectés. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1

Pour vérifier si miR-29a-3p a contribué à inverser la fibrose hépatique induite par les œufs, des souris ont été infectées avec une dose modérée de parasites. À 6 semaines après l'infection, lorsque la fibrose hépatique s'est clairement manifestée, toutes les souris infectées ont été traitées avec du praziquantel pour tuer le parasite, puis injectées avec miR-29a-3p agomir, NC agomir ou PBS tous les 4 jours pendant 28 jours et autopsiées à 10 semaines après l'infection (Fig. 6A). Des échantillons de foie et de rate du groupe traité avec miR-29a-3p agomir ont présenté une réponse granulomateuse modérée et une splénomégalie (Fig. 6B). Le traitement antifibrosant a significativement réduit les indices hépatiques et spléniques (Fig. 6C, D). De plus, les souris traitées avec l'agomir miR-29a-3p ont montré des réductions significatives des taux circulants d'ALT et d'AST, ce qui suggère que le traitement a atténué les dommages hépatocellulaires (Fig. 6E, F). Les souris qui ont reçu l'agomir miR-29a-3p ont présenté une réduction significative du dépôt d'ECM, comme le montre la quantification de l'hydroxyproline (Fig. 6G), la coloration au trichrome de Masson et la coloration au rouge Sirius (Fig. 6B, H et I), et une nette réduction de la taille des granulomes hépatiques, comme visualisé sur la coloration H&E (Fig. 6B, J). Cependant, les foies n'ont montré aucun changement significatif dans la charge en œufs parmi les trois groupes infectés (Fichier supplémentaire 4 : Fig. S4B). De manière constante, une coloration immunohistochimique représentative et une analyse qPCR ont démontré des niveaux d'expression réduits des marqueurs de fibrose dans le foie des souris traitées avec l'agomir miR-29a-3p (Fig. 6B, K – N).

miR-29a-3p élévation induite par l'agomir de miR-29a-3p partiellement inversée fibrose hépatique induite par le schistosome. Les souris ont été infectées par voie percutanée avec 16 cercaires de Schistosoma japonicum ou sont restées non infectées. À 6 semaines après l'infection, les souris infectées ont été traitées avec du praziquantel pour tuer les parasites, puis ont reçu miR-29a-3p agomir, NC agomir ou PBS tous les 4 jours pendant 28 jours. Les souris ont été autopsiées 10 semaines après l'infection. A Calendrier pour l'infection parasitaire et l'administration d'un médicament antiparasitaire ou miR-29a-3p agomir et prélèvement d'échantillon. B Macrographies de foies et de rates de souris non infectées, de souris infectées et de souris infectées traitées avec miR-29a-3p agomir. Barre d'échelle, 1 cm. Coloration H&E, trichrome de Masson et rouge Sirius de coupes de foie et coloration immunohistochimique pour le collagène I et α-SMA. Barre d'échelle, 50 μm. C, D Les indices du foie et de la rate ont été déterminés (n = 3–5). E, F Les taux sériques d'ALT et d'AST ont été mesurés (n = 5). G La teneur en collagène dans le foie a été déterminée par la teneur en hydroxyproline (n = 4–5). H Scores de fibrose mesurés à partir de la coloration au trichrome de Masson des coupes de foie (n = 5). I Les zones positives pour la coloration au rouge Sirius ont été mesurées à l'aide du logiciel IPP (n = 5). J Taille du granulome mesurée à partir de coupes de foie colorées au H&E (n = 5). K – N L'expression de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 dans le foie au cours de l'infection a été détectée par qPCR (n = 4). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. Des comparaisons multiples ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (C–N). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1 ; ALT : alanine aminotransférase ; AST : aspartate aminotransférase

Comme prévu, une expression significativement élevée de miR-29a-3p a été observée chez les souris infectées traitées avec miR-29a-3p agomir par rapport aux groupes NC agomir et PBS (7,2 à 9,9 fois) (Fig. 7A), ce qui a entraîné expression de Robo1 nettement diminuée, déterminée par qPCR et Western blot (Fig. 7B – D). Semblable à celle des souris MIR29A, la colocalisation des CSH Robo1 et α-SMA+ a été détectée dans le foie des souris infectées. Pendant ce temps, l'expression de Robo1 dans les CSH de souris infectées traitées avec l'agomir miR-29a-3p était plus faible que chez les souris infectées traitées avec l'agomir NC ou le PBS (Fig. 7E). Les niveaux d'ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 ont également été régulés à la baisse dans les CSH infectées de souris traitées avec l'agomir miR-29a-3p (Fig. 7F – I). Prises ensemble, ces données ont démontré que la régulation à la hausse de miR-29a-3p réduisait l'expression de Robo1 et empêchait l'activation des HSC induite par la schistosomiase.

miR-29a-3p induite par l'agomir élévation de miR-29a-3p empêché l'activation HSC pendant l'infection schistosome. Les niveaux d'expression A, B miR-29a-3p et Robo1 dans le foie ont été déterminés par qPCR (n = 3–4). La protéine C, D Robo1 a été déterminée par Western blot, quantifiée à l'aide d'ImageJ et normalisée à GAPDH (n = 3). E–I Les CSH primaires ont été isolées des tissus hépatiques de souris. E Coloration par immunofluorescence représentative de la colocalisation de Robo1 (vert) avec α-SMA (rouge) dans les HSC primaires. Barre d'échelle, 100 μm. F–I L'expression de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 dans les CSH primaires au cours de l'infection a été détectée par qPCR (n = 3–4). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD de deux expériences indépendantes. La signification a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (A, B, D, F–I). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1

Nous avons ensuite étudié si miR-29a-3p empêchait l'activation des HSC induite par le TGF-β1. En utilisant une lignée cellulaire HSC humaine immortalisée bien validée (LX-2), nous avons constaté que la surexpression de miR-29a-3p atténuait de manière significative les niveaux d'ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA et TGF-β1 dans les cellules LX-2. en présence de TGF-β1 (Fig. 8A – D). De plus, miR-29a-3p imite Robo1 fortement régulé à la baisse dans les cellules LX-2 en présence de TGF-β1 (Fig. 8E, F). Ces résultats ont démontré que la surexpression de miR-29a-3p atténuait l'activation des HSC en inhibant les voies Robo1 à la fois in vivo et in vitro.

La surexpression de miR-29a-3p a atténué l'activation des HSC en inhibant les voies Robo1. Les cellules LX-2 ont été prétraitées avec 50 nM miR-29a-3p imite ou leurs contrôles négatifs pendant 6 h, TGF-β1 (10 ng/ml) a été ajouté au milieu, et les niveaux d'expression des marqueurs de fibrose et Robo1 ont été déterminés après 48h d'incubation. A – E L'expression de Col1α1, Col3α1, α-SMA, TGF-β1 et Robo1 dans les cellules LX-2 a été détectée par qPCR (n = 3–6). La protéine F Robo1 a été déterminée par Western blot, quantifiée à l'aide d'ImageJ et normalisée à GAPDH (n = 4). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. Des comparaisons multiples ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (A–F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p : microARN-29a-3p ; Robo1 : Homologue du rond-point 1

Il a été précédemment suggéré que la régulation et la fonction des miARN sont hautement spécifiques au type d'organe et de cellule [41]. Les CSH sont la principale source de myofibroblastes dans le foie [5]. Nos résultats fournissent des preuves d'un rôle fonctionnel de miR-29a-3p dans la fibrose hépatique induite par l'infection à schistosomes humains et murins. Nos données ont montré que miR-29a-3p était régulé négativement dans les CSH au cours de la fibrose hépatique, et que Robo1 était régulé positivement. Notamment, nos résultats suggèrent que miR-29a-3p inverse partiellement la fibrose hépatique induite par le schistosome en ciblant Robo1 pour empêcher l'activation des CSH induite par la schistosomiase pendant l'infection.

Les membres de la famille MiR-29 sont considérés comme des fibromiR et il a été démontré qu'ils sont dérégulés au cours du processus de fibrose dans plusieurs organes [42]. Ces molécules régulent plusieurs isoformes de collagène et d'autres composants de la MEC [43]. En général, une diminution de l'expression des membres de la famille miR-29 est associée à une augmentation du dépôt d'ECM et de la fibrose dans divers tissus. Le rôle des espèces miR-29 a été largement étudié dans des modèles animaux et des biopsies de patients atteints de fibrose hépatique [17, 26, 27]. Cependant, aucune étude à ce jour n'a examiné le rôle de miR-29 dans la fibrose hépatique causée par la schistosomiase. Dans la présente étude, nous avons constaté que miR-29a-3p était diminué dans les tissus hépatiques atteints de fibrose hépatique induite par la schistosomiase. Des études antérieures ont identifié que Robo1, en tant que cible potentielle de miR-29a-3p, était un gène cible du TGF-β1 dans les cellules mammaires [44], ce qui indiquait que Robo1 pourrait être impliqué dans la progression de la fibrose hépatique. Pendant ce temps, nous avons examiné l'expression de Robo1 chez des patients témoins et atteints de schistosomiase. Nos résultats ont montré que le niveau d'expression de Robo1 était significativement plus élevé dans les tissus hépatiques atteints de fibrose hépatique. De plus, les niveaux d'ARNm de miR-29a-3p et de Robo1 dans les tissus hépatiques des patients atteints de fibrose étaient liés au diamètre de la veine porte et à l'épaisseur de la rate, qui augmentaient parallèlement à l'étendue de la fibrose hépatique [45, 46]. Plus important encore, nous avons montré que les cellules productrices de Robo1 étaient principalement situées dans les HSC. Nous avons en outre constaté que l'expression de Robo1 dans les CSH était significativement augmentée après l'infection. Ces résultats suggèrent que miR-29a-3p et Robo1 sont impliqués dans la pathogenèse de la fibrose hépatique via les CSH lors d'une infection schistosomique.

Pour confirmer davantage les rôles de miR-29a-3p et Robo1 in vivo, nous avons établi un modèle murin d'infection à S. japonicum sur la base des informations d'études antérieures [6, 47]. Par rapport au groupe non infecté, les souris infectées par le schistosome ont montré une expression plus faible de miR-29a-3p et une expression plus élevée de Robo1 dans les tissus hépatiques, et ces niveaux d'expression étaient associés au stade avancé de la fibrose hépatique. De plus, le niveau d'expression de miR-29a-3p était significativement régulé à la baisse dans les CSH de souris infectées par rapport aux hépatocytes et aux KC. De manière cohérente, nos données ont également indiqué que la production de Robo1 était principalement co-localisée avec les HSC lors de l'infection par le schistosome. De plus, la relation de ciblage entre miR-29a-3p et Robo1 a été confirmée à l'aide de HSC primaires de souris et de la lignée cellulaire HSC humaine LX-2. Ces résultats appuient nos données fonctionnelles sur le rôle de la signalisation miR-29a-3p-Robo1 dans les CSH et suggèrent que cette signalisation est impliquée dans la pathogenèse de la fibrose hépatique via les CSH lors d'une infection schistosomique.

L'activation anormale des CSH est depuis longtemps établie comme un événement critique au cours de la pathogenèse de la fibrose hépatique [5]. Des études antérieures ont démontré la présence de CSH activées à la périphérie des granulomes d'oeufs de S. japonicum dans les infections murines et humaines, et ces cellules sont probablement des cellules effectrices qui contribuent à la fibrose associée au granulome, ce qui souligne l'importance des modulateurs de cellules stellaires dans la progression de schistosomiase hépatique [6]. De plus en plus de preuves suggèrent que miR-29a a une activité antifibrotique. Huang et al. ont rapporté que des souris transgéniques surexprimant miR-29a amélioraient la fibrose hépatique en modulant le phénotype profibrogénique des CSH après BDL ou un régime riche en graisses [48, 49]. Une étude prometteuse a démontré une récupération accélérée de la fibrose hépatique induite par le CCl4 après l'administration de miR-29a via la veine caudale [50]. Notre étude a démontré que la surexpression de miR-29a-3p chez des souris infectées par des schistosomes entravait significativement les dommages hépatocellulaires et la fibrose hépatique. En outre, la surexpression de miR-29a-3p a considérablement réduit l'expression de Robo1 dans les HSC activés et a diminué l'activation des HSC induite par la schistosomiase. Le TGF-β1 est la cytokine pro-fibrogène la plus puissante [51]. Des études antérieures ont identifié que le TGF-β1 jouait un rôle important dans la pathogenèse de la schistosomiase [52]. Pour étudier l'interaction entre miR-29a-3p et Robo1 et l'effet de cette interaction sur l'activation des HSC, nous avons transfecté un agomir miR-29a-3p dans des cellules LX-2, suivi d'une exposition au TGF-β1. Comme prévu, nous avons constaté que la surexpression de miR-29a-3p diminuait de manière significative l'expression de Robo1 et de collagène induite par le TGF-β1. Ces données ont collectivement démontré que la signalisation de miR-29a-3p-Robo1 dans les HSC était à l'origine de la pathogenèse de la fibrose hépatique et que la surexpression de miR-29a-3p avait un effet bénéfique sur la fibrose hépatique induite par le schistosome en réduisant l'expression de Robo1 et en empêchant l'activation des HSC pendant l'infection.

Comme illustré ci-dessus, nos résultats fournissent des preuves expérimentales et cliniques que la voie de signalisation miR-29a-3p-Robo1 dans les CSH joue un rôle important dans le développement de la fibrose hépatique et suggèrent fortement que la surexpression de miR-29a-3p peut inverser la voie induite par les schistosomes. fibrose hépatique en supprimant l'activation des HSC pendant l'infection. Bien que le praziquantel puisse cibler et tuer efficacement les schistosomes, la progression de la fibrose hépatique persiste [53]. À ce jour, il n'existe aucun traitement antifibrotique approuvé. Nos données ont clairement démontré que la surexpression de miR-29a-3p soulageait une telle fibrose hépatique en supprimant l'activation des HSC. Ainsi, miR-29a-3p constitue un candidat prometteur pour le développement d'outils thérapeutiques pour prévenir ou traiter la fibrose hépatique. Cependant, d'autres études sont clairement justifiées.

Nos résultats ont révélé que la signalisation miR-29a-3p-Robo1 dans les CSH médiait la pathogenèse de la fibrose hépatique, et la surexpression de miR-29a-3p avait un effet bénéfique sur la fibrose hépatique induite par le schistosome en réduisant l'expression de Robo1 et en empêchant l'activation de CSH au cours de l'infection. Par conséquent, notre étude donne un aperçu des mécanismes de régulation de miR-29a-3p de la fibrose hépatique de la schistosomiase et met en évidence le potentiel de miR-29a-3p en tant qu'intervention thérapeutique pour les maladies fibrotiques.

Toutes les données soutenant les conclusions de cette étude sont incluses dans l'article.

Alanine aminotransférase

Aspartate aminotransférase

α-Actine musculaire lisse

Ligature des voies biliaires

Le tétrachlorure de carbone

Matrice extracellulaire

Sérum bovin fœtal

Hépatocytes

Cellules étoilées hépatiques

Cellules de Kupffer

MicroARN

MicroARN-29a-3p

ARN messager PBS Tampon phosphate salin

Tampon phosphate salin

Homologue du rond-point 1

Schistosoma japonicum

Facteur de croissance transformant-β1

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Nous remercions le personnel du Département de parasitologie, École de médecine fondamentale, Tongji Medical College, Université des sciences et technologies de Huazhong, pour leur aide dans les infections parasitaires.

Cette étude a été soutenue par le National Science and Technology Major Project (n° 2014ZX10005001 ; n° 2018ZX10302204-001) et le projet de recherche scientifique de la Commission de la santé de la province du Hubei (n° WJ2021M20). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Département et Institut des maladies infectieuses, Hôpital Tongji, Collège médical de Tongji, Université des sciences et technologies de Huazhong, Wuhan, Chine

Hongyan Kong, Dandan Xiang, Shuaiwen Huang, Xin Xu, Jinan He, Lanyue Pan, Ran Tao, Haijing Yu et Jiaquan Huang

Cancer Institute, Shenzhen Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer Translational Research, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen Peking University-the Hong Kong University of Science and Technology (PKU-HKUST) Medical Center, Institute of Cancer Research, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, Chine

Chanson Qiqin

Département de gastro-entérologie, Hôpital populaire de Jianshi, Enshi, Chine

Wenjiang Hu

Département de pédiatrie, Hôpital Tongji, Collège médical de Tongji, Université des sciences et technologies de Huazhong, Wuhan, Chine

Shusen Guo

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HK, QS et JH ont conçu l'étude. HK, QS, WH, SG, DX, SH, XX, JH, LP, RT et HY ont acquis les données expérimentales. HK et JH ont contribué aux analyses de données et ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Jiaquan Huang.

L'étude humaine a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital de Tongji, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (numéro de permis : 20150103). Les études ont été réalisées conformément à la Déclaration d'Helsinki et avec le consentement éclairé écrit de chaque patient. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées en stricte conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (IACUC n° 629).

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

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Schéma de principe de la construction de la souris MIR29A. Le locus Hipp11 (H11) est situé dans une région intergénique entre les gènes Eif4enif1 et Drg1 sur le chromosome 11 de la souris. Le gène humain MIR29A (NCBI ReferenceSequence : NR_029503.1) est situé sur le chromosome 7 humain. Pour le modèle de knock-in conditionnel, la cassette "CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA" a été insérée dans le locus H11 (~ 0,7 kb 5' du gène Eif4enif1 et ~ 4,5 kb 3' du gène Drg1). Cas9 et gRNA ont été co-injectés dans des œufs fécondés avec un vecteur de ciblage pour la production de souris. Les chiots ont été génotypés par PCR suivi d'une analyse de séquençage.

Pureté des CSH isolées. (A, B) Résultats représentatifs pour la purification HSC par cytométrie en flux et immunofluorescence. Les encarts montrent un grossissement plus élevé de la zone délimitée. Barre d'échelle, 50 μm.

Les souris MIR29A avaient des niveaux plus élevés de miR-29a-3p dans différents organes. Les niveaux d'expression de miR-29a-3p dans différents organes de souris WT et de souris MIR29A ont été déterminés par qPCR. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par le test t de Student bilatéral. ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p : microARN-29a-3p.

Altération de la charge parasitaire dans les différents groupes au cours de l'infection par les schistosomes. Altération de la charge parasitaire chez les souris WT et les souris MIR29A infectées. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par le test t de Student bilatéral (A) ou l'ANOVA unidirectionnelle avec correction de Tukey pour les comparaisons entre deux groupes (B). miR-29a-3p : microARN-29a-3p.

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Réimpressions et autorisations

Kong, H., Song, Q., Hu, W. et al. Le microARN-29a-3p prévient la fibrose hépatique induite par Schistosoma japonicum en ciblant l'homologue Roundabout 1 dans les cellules étoilées hépatiques. Vecteurs parasites 16, 184 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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Reçu : 26 janvier 2023

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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