Un vaccin ARNm AgTRIO contre le moustique contribue à l'immunité contre le paludisme

npj Vaccins volume 8, Numéro d'article : 88 (2023) Citer cet article

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Le paludisme commence lorsqu'un moustique infecté injecte de la salive contenant des sporozoïtes de Plasmodium dans la peau d'un hôte vertébré. Pour prévenir le paludisme, la vaccination est la stratégie la plus efficace et il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies pour améliorer les vaccins actuels à base d'agents pathogènes. L'immunisation active ou passive contre une protéine salivaire de moustique, AgTRIO, contribue à la protection contre l'infection à Plasmodium des souris. Dans cette étude, nous avons généré une nanoparticule AgTRIO ARNm-lipide (LNP) et évalué son utilité potentielle en tant que vaccin contre le paludisme. L'immunisation de souris avec un ARNm-LNP AgTRIO a généré une réponse humorale robuste, y compris des anticorps d'isotype AgTRIO IgG2a qui ont été associés à une protection. Les souris immunisées par l'ARNm-LNP AgTRIO exposées à des moustiques infectés par Plasmodium berghei avaient nettement réduit les niveaux initiaux d'infection hépatique à Plasmodium et augmenté la survie par rapport aux souris témoins. De plus, alors que la réponse humorale à AgTRIO diminuait sur 6 mois, des piqûres de moustiques supplémentaires augmentaient les titres d'AgTRIO IgG, y compris les isotypes IgG1 et IgG2a, ce qui offre un avantage unique par rapport aux vaccins à base d'agents pathogènes. Ces données aideront à la génération de futurs vaccins antipaludiques pouvant inclure à la fois des antigènes pathogènes et vecteurs.

Le paludisme humain peut être causé par au moins 5 espèces différentes de Plasmodium1. Pour prévenir l'infection, la vaccination est la stratégie la plus efficace. Cependant, aucun vaccin hautement efficace contre le paludisme n'a été développé à ce jour2,3,4. Plusieurs candidats vaccins sont en essais cliniques. L'un des vaccins les plus avancés - qui vient d'être approuvé par l'OMS en 2021 - est un vaccin à base d'agents pathogènes, RTS,S. RTS,S cible la protéine circumsporozoïte de Plasmodium falciparum (PfCSP) en conjonction avec des épitopes immunostimulateurs de l'antigène de surface de l'hépatite B et l'adjuvant AS015. L'efficacité de la protection est modérée avec une réduction de 30 à 50 % de l'infection dans les essais cliniques, et la protection diminue avec le temps5,6,7,8. De plus, la protection est limitée à P. falciparum et il existe toujours un risque d'infection par d'autres espèces de Plasmodium, deux faiblesses qui limitent les possibilités d'éradication du paludisme9. En outre, l'émergence généralisée de la résistance aux médicaments chez les parasites du paludisme et de la résistance aux insecticides chez les moustiques vecteurs rend impératif de développer des stratégies pour identifier les cibles vaccinales qui agissent en synergie avec la CSP, ou qui fonctionnent indépendamment de la CSP.

Le paludisme est transmis lorsqu'un moustique anophèle femelle infecté prend un repas de sang et injecte des sporozoïtes de Plasmodium avec de la salive dans la peau de l'hôte vertébré10,11. Après une piqûre de moustique, les sporozoïtes voyagent dans les vaisseaux sanguins jusqu'au foie, où ils envahissent les hépatocytes et établissent l'infection12. La salive des moustiques contient des molécules biologiquement actives, qui modulent les réponses immunitaires et hémostatiques de l'hôte13,14,15,16,17,18,19,20, et peuvent également influencer l'infection à Plasmodium. Des rapports font état d'interactions intimes entre les protéines des glandes salivaires des moustiques anophèles et Plasmodium avant et après la migration de Plasmodium hors du moustique21,22,23,24. Il a également été démontré que les sérums hyperimmuns contre les extraits de glandes salivaires de moustiques peuvent contenir des anticorps à titre élevé contre des composants de la salive qui ne sont normalement pas antigéniques lors d'une piqûre naturelle de moustique, et que ces sérums peuvent fournir une certaine protection contre la transmission de Plasmodium23. Plus précisément, nous avons identifié au moins un antigène, AgTRIO de la salive d'Anopheles gambiae, qui produit des anticorps qui diminuent l'infection palustre à la fois dans un modèle murin traditionnel et dans un modèle murin humanisé de paludisme23. Les anticorps AgTRIO offrent également une protection synergique lorsqu'ils sont associés à un anticorps monoclonal CSP23. Ces études suggèrent que l'immunisation contre AgTRIO peut contribuer à la protection contre l'infection à Plasmodium et pourrait être utile en combinaison avec des immunogènes pathogènes.

Les vaccins à ARNm constituent une avancée technologique importante pour prévenir les maladies infectieuses, comme l'a démontré la pandémie de SRAS-CoV225,26. Plusieurs études utilisant des vaccins à ARNm ciblant PfCSP ont prouvé son utilité, bien que sans protection complète, dans des modèles murins d'infection à Plasmodium27,28,29. En outre, le ciblage de plusieurs antigènes est facilement réalisable à l'aide de vaccins à ARNm29,30,31, qui peuvent potentiellement générer une réponse antipaludique plus puissante pour améliorer un vaccin à base de PfCSP. Nous avons produit une nanoparticule lipidique (LNP) contenant un ARNm codant pour la protéine de salive de moustique AgTRIO. L'immunisation de souris C57BL/6 avec le vaccin AgTRIO ARNm-LNP a diminué la charge initiale de Plasmodium dans le foie et la parasitémie subséquente, suite à une exposition à des moustiques infectés par Plasmodium. De plus, la réponse IgG contre AgTRIO peut être stimulée par les piqûres de moustiques, ce qui pourrait potentiellement résoudre un problème lié à la durée de protection observée dans les vaccins à base d'agents pathogènes. Sur la base de ces données, un vaccin AgTRIO ARNm-LNP pourrait être utile dans le cadre d'une approche vaccinale multiantigène contre le paludisme.

Pour déterminer si l'ARNm-LNP d'AgTRIO peut générer des anticorps spécifiques d'AgTRIO, des souris C57BL / 6 ont été immunisées trois fois avec 10 μg d'ARNm-LNP d'AgTRIO ou de contrôle, l'ARNm-LNP de la luciférase (Luc) (Fig. 1a). Deux semaines après chaque injection, le sang a été prélevé et analysé par un dosage immuno-enzymatique (ELISA) à l'aide d'un AgTRIO purifié dérivé d'E. coli (Fig. 1b). L'immunisation avec l'ARNm-LNP d'AgTRIO a généré des réponses IgG significatives après la première immunisation de rappel. Pour déterminer si l'immunisation a donné lieu à des anticorps reconnaissant l'AgTRIO natif, nous avons collecté des extraits de glandes salivaires (SGE) d'Anopheles gambiae femelles, puis enduit des plaques de SGE pour ELISA. L'immunisation avec l'ARNm-LNP AgTRIO a généré des anticorps significatifs contre SGE (Fig. 1c). Dans notre étude récente, nous avons constaté que la sous-classe IgG de l'anticorps monoclonal AgTRIO (mAb) peut influencer l'effet protecteur contre l'infection à Plasmodium32. En particulier, un mAb IgG2a murin contre AgTRIO offrait la protection la plus puissante32. Par ELISA, nous avons constaté que l'ARNm-LNP d'AgTRIO générait divers isotypes d'anticorps contre AgTRIO, y compris des anticorps IgG2a (Fig. 1d).

a Schéma d'expérience montrant des groupes de souris femelles C57BL / 6 injectées avec 10 μg d'ARNm-LNP AgTRIO ou d'ARNm de contrôle (ARNm Luc-LNP) et stimulées deux fois, à des intervalles de deux semaines. b Deux semaines après chaque immunisation, les souris ont été saignées. Des dilutions de 1:2 500 et 1:12 500 de sérums ont été examinées pour les anticorps IgG spécifiques d'AgTRIO par ELISA en utilisant AgTRIO recombinant comme antigène. c Une dilution de 1:2 500 des sérums collectés après la finale a été examinée pour les anticorps IgG spécifiques d'AgTRIO contre des extraits de glandes salivaires par ELISA. (Médiane ± IQR, p < 0,05 en utilisant le test U de Mann Whitney) d Une dilution de 1:2 500 de sérums a été utilisée pour déterminer les IgG1, IgG2a et IgG2b spécifiques à AgTRIO. Une dilution de 1:500 des sérums a été examinée pour les anticorps IgG3 spécifiques d'AgTRIO.

Dans notre étude précédente, l'immunisation active avec AgTRIO ou le transfert passif avec les antisérums AgTRIO offraient une protection partielle contre l'infection à Plasmodium transmise par les moustiques chez la souris23. AgTRIO ARNm-LNP trois fois à deux semaines d'intervalle. Le groupe témoin a reçu 10 μg de Luc RNA-LNP. Trois semaines après la dernière immunisation, nous avons provoqué les souris en utilisant chacune 3 moustiques A gambiae infectés par P. berghei. Les souris immunisées avec l'ARNm-LNP AgTRIO avaient des niveaux hépatiques médians de P. berghei réduits de 68% par rapport à celles immunisées avec l'ARNm-LNP Luc (Fig. 2a, p = 0, 048). Pour examiner plus en détail les effets de cet ARNm-LNP AgTRIO sur le développement des stades ultérieurs de l'infection palustre, tels que la parasitémie, nous avons immunisé un groupe supplémentaire de souris avec 10 μg d'ARNm-LNP AgTRIO ou Luc mARN-LNP trois fois, puis exposé les animaux à trois moustiques infectés par P. berghei. 5 jours après l'exposition aux piqûres de moustiques infectés, il y avait significativement moins de parasitémie dans le groupe ayant reçu le vaccin AgTRIO ARNm-LNP (Fig. 2b, p = 0,012). Ensuite, nous avons utilisé les courbes de survie de Kaplan-Meier pour démontrer la cinétique de la parasitémie à 0, 01% comme preuve de l'infection (Fig. 2c). Conformément aux résultats de la charge hépatique et de la parasitémie au jour 5, il y avait moins de souris infectées dans le groupe ayant reçu le vaccin AgTRIO ARNm-LNP (p = 0,036 selon le test du Log rank). Toutes ces données démontrent que l'immunisation avec l'ARNm-LNP d'AgTRIO peut réduire considérablement la charge hépatique de Plasmodium dans le modèle murin et contribuer à la protection contre le paludisme.

Des souris C57BL/6 ont été immunisées trois fois avec 10 µg d'ARNm-LNP AgTRIO ou d'ARNm témoin (Luc). 3 semaines après le dernier rappel, les souris immunisées ont été exposées à 3 moustiques infectés par P. berghei. a Après 40 h, les foies ont été disséqués et le niveau d'infection à Plasmodium a été déterminé par RT-PCR. (Médiane ± IQR, p < 0,05 en utilisant le test U de Mann Whitney). b Dans une expérience distincte avec des souris vaccinées de la même manière et exposées à des piqûres de moustiques infectés, les niveaux de parasitémie ont été déterminés au jour 5 après l'infection. (Médiane ± IQR, p < 0,05 en utilisant le test U de Mann Whitney). c Les courbes de survie de Kaplan-Meier ont été utilisées pour présenter le pourcentage de souris non infectées. L'infection a été déterminée comme 0,01 % de parasitémie par cytométrie en flux. p = 0,036 par test du Log rank entre les deux groupes.

Comme AgTRIO est fortement exprimé dans la salive des moustiques23, nous avons ensuite examiné si la baisse des réponses IgG qui se produit naturellement après toute vaccination peut, dans le cas d'AgTRIO, être stimulée par les piqûres de moustiques. Nous avons immunisé des souris C57BL/6 avec trois doses d'AgTRIO ARNm-LNP et déterminé les titres d'IgG à intervalles réguliers. 18 semaines après le début des expériences (14 semaines après la dernière immunisation de rappel), les titres d'IgG contre AgTRIO (médiane : 0,45) avaient diminué d'environ 40 % par rapport à 10 semaines après le début des expériences (médiane : 0,716, figure 3a). Ensuite, un groupe de souris a été exposé à 10 piqûres de moustiques non infectés par semaine pendant 3 semaines et le groupe témoin de souris n'a pas été exposé à AgTRIO. Lors de l'alimentation sur des souris, aucun effet indésirable significatif n'a été noté lors de piqûres répétées de moustiques. La concentration d'IgG anti-AgTRIO a nettement augmenté dans le groupe exposé aux piqûres de moustiques tandis que les taux d'IgG ont continué à diminuer dans le groupe témoin (Fig. 3a, p = 0,03 par le test de rang signé Wilcoxon). Ensuite, nous avons déterminé quelles sous-classes d'IgG d'anticorps spécifiques AgTRIO ont été stimulées par les piqûres de moustiques. Par ELISA, les IgG1 et IgG2a spécifiques d'AgTRIO ont augmenté de manière significative après les piqûres de moustiques (Fig. 3b). Ces résultats montrent que les piqûres de moustiques peuvent maintenir la réponse IgG contre AgTRIO après la vaccination, y compris les isotypes IgG qui ont été associés à la protection32.

Un groupe de souris a reçu une injection de 10 μg d'AgTRIO ARNm-LNP ou d'ARNm de contrôle (Gluc ARNm-LNP) et a reçu un rappel deux fois sur 4 semaines. Les sérums ont été prélevés 10, 18 et 25 semaines après le début des expériences. une dilution de 1:2 500 de sérums a été examinée pour les anticorps IgG totaux spécifiques d'AgTRIO par ELISA. b Une dilution de 1:2 500 de sérums a été utilisée pour déterminer les IgG1, IgG2a et IgG2b spécifiques d'AgTRIO. Une dilution de 1:500 des sérums a été examinée pour les anticorps IgG3 spécifiques d'AgTRIO. (Médiane ± IQR, p < 0,05 en utilisant le test de rang signé des paires appariées de Wilcoxon). Barre rouge : exposé à 10 moustiques par semaine après 18 semaines pendant trois fois. Barre bleue : non-exposition.

Lorsqu'ils recherchent un repas de sang, les moustiques sécrètent de la salive pour faciliter l'alimentation et des sporozoïtes sont simultanément libérés dans la peau10,11. Par conséquent, les composants de la salive peuvent affecter directement ou indirectement la transmission de Plasmodium au site de la morsure et sont des cibles potentielles pour la prévention de la maladie23,33. Dans nos études précédentes, nous avons démontré qu'une immunisation passive ou active contre l'une des protéines salivaires, AgTRIO, offre une protection partielle contre P. berghei et P. falciparum transmis par les piqûres de moustiques A. gambiae ou A. stephensi23. De plus, nous avons démontré qu'AgTRIO est fortement sécrété dans la salive des moustiques et que les moustiques chez lesquels AgTRIO a été réduit au silence par l'ARNi ne transmettent pas efficacement les sporozoïtes à la peau murine par rapport aux moustiques témoins22,23. Cela fait d'AgTRIO un candidat approprié pour être inclus dans un vaccin à plusieurs composants. Dans cette étude, nous avons généré un ARNm-LNP AgTRIO qui induit des réponses humorales spécifiques à AgTRIO, y compris des anticorps d'isotype IgG2a qui ont été associés à une protection32. L'ARNm-LNP d'AgTRIO a significativement réduit l'infection à Plasmodium chez la souris. Notre découverte indique que l'immunisation contre AgTRIO, en utilisant une approche d'ARNm, peut contribuer à la protection contre la transmission de Plasmodium de l'arthropode à un hôte vertébré.

Dans notre étude précédente, les souris immunisées avec la protéine AgTRIO dans l'adjuvant complet de Freund puis boostées avec la protéine AgTRIO avec l'adjuvant incomplet de Freund présentaient une charge hépatique inférieure de 50 % par rapport au groupe témoin23. Dans la même étude, 66 % des souris immunisées contre AgTRIO présentaient une parasitémie détectable, contre 95 % des souris témoins23. Alors que l'adjuvant de Freund est utile pour démontrer la preuve de principe car il est hautement immunostimulant, et il ne peut pas être administré aux humains en raison de ses effets secondaires toxiques. En utilisant l'approche de l'ARNm AgTRIO, 44,4 % (4/9) des souris ayant reçu l'ARNm-LNP AgTRIO ont atteint un niveau de parasitémie de 0,01 % après provocation, contre 88,8 % (8/9) du groupe témoin. Dans notre étude précédente, un anticorps monoclonal IgG2a AgTRIO offrait une protection substantielle contre l'infection à Plasmodium chez la souris par rapport aux autres anticorps monoclonaux d'isotype, et la protection dépendait de la région Fc32. Dans nos résultats non publiés, il y avait des réponses IgG1 et IgG2b spécifiques AgTRIO après immunisation avec la protéine AgTRIO et l'adjuvant Alum, mais il n'y avait pas de réponse IgG2a significative. AgTRIO-ARNm LNP fournit une réponse isotypique IgG robuste, y compris la génération d'anticorps IgG2a, qui peuvent offrir une protection plus efficace contre l'infection à Plasmodium. Tous ces résultats démontrent que l'approche AgTRIO ARNm-LNP peut offrir des avantages par rapport aux vaccins à base de protéines.

De plus, suite à une infection ou à une vaccination, la diminution des réponses immunitaires protectrices se produit avec le temps et constitue la principale préoccupation. A titre d'exemple, pour la plupart des vaccins COVID-19, la réponse humorale diminue de plus de 50% après 6 mois34,35,36,37,38. Pour maintenir des réponses humorales protectrices, un vaccin de rappel est nécessaire. Semblables à d'autres vaccins, les vaccins à base de PfCSP présentent une protection décroissante avec le temps6,7. Alors que la réponse humorale envers AgTRIO a diminué après 6 mois de vaccination, les anticorps pourraient être stimulés par les piqûres de moustiques. D'autre part, il n'y a pas de réponse immunitaire humorale significative contre AgTRIO après des piqûres répétées de moustiques chez l'homme ou la souris23, ce qui indique que l'effet de rappel ne se produit qu'après l'amorçage par immunisation active avec AgTRIO. Il n'y a eu aucun effet indésirable significatif, y compris une rougeur, un gonflement ou une réaction allergique, noté lors de piqûres de moustiques répétées après immunisation avec le vaccin AgTRIO ARNm-LNP dans notre étude. Cependant, il est important d'examiner la sécurité directement chez l'homme, car les résultats chez la souris ne sont pas toujours directement corrélés avec les humains. Cet effet stimulant acquis naturellement confère à l'immunisation à base d'AgTRIO un avantage unique par rapport au vaccin traditionnel à base d'agents pathogènes. Dans les zones d'endémie palustre, une exposition persistante au vecteur pourrait facilement augmenter et maintenir les anticorps AgTRIO chez les individus vaccinés avec l'ARNm-LNP AgTRIO. Dans l'ensemble, notre étude démontre qu'une stratégie de vaccin à ARNm ciblant une protéine salivaire de moustique peut aider au développement de la prochaine génération de vaccins contre le paludisme et peut être utilisée en conjonction avec des vaccins traditionnels à base de Plasmodium.

Les moustiques A. gambiae (souche 4arr) ont été élevés à 27 ° C, 80% d'humidité, sous un cycle lumière / obscurité de 12/12 h et maintenus avec 10% de saccharose dans des conditions de laboratoire standard à l'insectarium de l'Université de Yale. Les souris Swiss Webster et C57BL/6 ont été achetées chez Charles River Laboratories. Tous les protocoles d'expérimentation animale ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Yale (numéro de protocole : 2022-07941). Toutes les infections à Plasmodium ont été réalisées dans des animaleries de niveau de sécurité biologique 2. Toutes les expériences sur les animaux ont suivi le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Dans toutes les expériences, les souris ont été hébergées et soignées dans les installations pour animaux accréditées par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC) à l'Université de Yale. Pour la collecte de sang rétro-orbitale ou l'alimentation des moustiques, les souris ont été anesthésiées avec une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (100 mg/10 mg par kg de poids corporel). Lorsque toutes les expériences ont été terminées, les souris ont été euthanasiées à l'aide d'une chambre à CO2 d'une manière conforme aux directives de l'AVMA pour l'euthanasie. Après la mort, les souris ont été soumises à une dislocation cervicale comme moyen secondaire d'assurer la mort.

AgTRIO (AGAP001374) sans le peptide signal ont été optimisés en codons entre les 22e et 389e acides aminés, puis les ARNm AgTRIO ou luciférase (contrôle) ont été transcrits pour contenir des queues poly (A) de 101 nucléotides. Le N-1-méthylpseudouridine (m1Ψ-5′)-triphosphate au lieu de l'UTP a été utilisé pour générer de l'ARNm contenant des nucléosides modifiés. Le coiffage des ARNm transcrits in vitro a été réalisé de manière co-transcriptionnelle à l'aide de l'analogue trinucléotide cap1, CleanCap. L'ARNm a été purifié par purification sur cellulose39. L'ARNm a ensuite été encapsulé dans des LNP à l'aide d'une solution aqueuse d'ARNm à pH acide 4,0 et mélangé à une solution de lipides40,41, consistant en un lipide cationique ionisable/phosphatidylcholine/cholestérol/PEG-lipide (50:10:38,5:1,5 mol /mol)28,29,30,31. Pour l'encapsulation, l'ARN a été mélangé avec les lipides dans un rapport d'environ 0, 05 (wt/wt). Le LNP avait un diamètre d'environ 80 nm tel que mesuré par diffusion dynamique de la lumière à l'aide d'un instrument Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Royaume-Uni) et est stocké à -80 ° C.

Des souris C57BL/6 femelles âgées de cinq semaines ont été immunisées avec 10 µg d'ARNm-LNP AgTRIO ou de contrôle (ARNm Luc-LNP), puis ont reçu des rappels avec la même quantité de vaccin 2 et 4 semaines plus tard. Deux semaines après chaque immunisation, le sérum a été prélevé sur chaque souris et les réponses IgG ont été testées en utilisant un ELISA pour confirmer les anticorps spécifiques de l'antigène. Pour déterminer si la piqûre de moustique peut stimuler l'IgG, après la décomposition des titres AgTRIO IgG, nous avons laissé 10 moustiques non infectés se nourrir des souris. Les souris témoins n'ont pas été exposées aux moustiques.

La charge de Plasmodium dans les foies après une infection par des sporozoïtes a été déterminée en évaluant le niveau d'expression de l'ARNr 18 S de P. berghei, normalisé au facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes de M. musculus, hnf4α, qui a été utilisé comme gène domestique pour le tissu hépatique23,33. Ces données ont été présentées sous la forme du nombre de copies du gène cible pour 10 000 copies du gène domestique. Le réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour purifier l'ARN total des foies murins. Toutes les extractions ont suivi les protocoles du fabricant. Le kit iScript RT-qPCR (Bio-Rad) a été utilisé pour générer de l'ADNc à partir d'ARN. En utilisant iTaq SYBR Green Supermix (Bio-Rad), une PCR en temps réel a été réalisée sur une plate-forme en temps réel CFX96 (Bio-Rad). La PCR impliquait une dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min, 50 cycles de 15 s à 95 °C, 15 s à 60 °C et 20 s à 72 °C. Les lectures de fluorescence ont été prises à 72°C après chaque cycle. À la fin de chaque réaction, une courbe de fusion (60 à 95 °C) a été vérifiée pour confirmer l'identité du produit de PCR. Les amorces utilisées pour l'expression des gènes des sporozoïtes sont répertoriées dans le tableau 1. Pour évaluer la parasitémie, 20 µl de sang ont été prélevés sur toutes les souris par saignement rétro-orbitaire. Le pourcentage de parasitémie a été déterminé en comparant les globules rouges GFP-positifs au nombre total de globules rouges par cytométrie en flux (CytoFLEX, ThermoFisher).

La séquence génétique AgTRIO sans la région correspondant au peptide signal a été clonée dans le vecteur d'expression bactérien, pET21b (GE Healthcare)23. Le plasmide exprimant AgTRIO sera transformé dans des cellules chimiquement compétentes BL21 (Thermo Fisher Scientific). L'expression de la protéine AgTRIO sera induite avec de l'IPTG 0,1 mM à 17 °C pendant 24 h. Les cellules seront soniquées dans du PBS avec des comprimés complets d'inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche). L'AgTRIO soluble sera purifié à partir du surnageant par une combinaison de chromatographie de dimensionnement, d'échange d'ions et d'affinité. L'expression d'AgTRIO recombinant sera confirmée par des immunoblots, qui seront sondés avec le sérum anti-AgTRIO dirigé contre AgTRIO de notre étude précédente23. La pureté des protéines sera déterminée par SDS-PAGE et la concentration sera déterminée par le kit de dosage BCA Protein (Pierce, IL).

Les réponses d'anticorps spécifiques à l'antigène ont été mesurées par ELISA42,43. Pour préparer l'extrait de glande salivaire (SGE), 20 glandes salivaires ont été recueillies dans 100 μl de PBS et la concentration de protéine SGE était de 0,2 mg/ml. Les microplaques à 96 puits ont été revêtues d'AgTRIO purifié (1 µg/ml) ou de SGE pendant une nuit. Après blocage avec un tampon de blocage (PBS, 0, 05% de tween-20 et 1% d'albumine de sérum bovin), différentes dilutions d'antisérums de souris ont été diluées dans du PBS et ajoutées aux puits et incubées à température ambiante pendant 2 heures. Après lavage avec un tampon de lavage (PBS, 0, 1% de tween-20), un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (Invitrogen, n ° de catalogue 62–6520) avec une dilution de 1: 10 000 a été utilisé pour détecter les IgG totales. Pour la détection des sous-classes d'IgG, des anticorps IgG1, IgG2a, IgG2b ou IgG3 de chèvre anti-souris conjugués à la peroxydase de raifort (Abcam, n° de catalogue ab97240, ab97245, ab97250, ab97260) avec une dilution de 1:10 000 ont été utilisés pour détecter sous-classe spécifique d'IgG.

P. berghei (ANKA GFPcon, ATCC) ont été maintenus par passages en série chez des souris femelles Swiss Webster ou C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines, comme décrit précédemment23. En bref, des souris Swiss Webster ou C57BL/6 ont été provoquées avec des globules rouges infectés par P. berghei par injection intrapéritonéale. Les moustiques A. gambiae ont ensuite pris un repas de sang des souris infectées, lorsque la parasitémie était d'environ 5 %. 17 à 24 jours après l'infection à P. berghei, les moustiques ont été triés en utilisant le signal fluorescent des glandes salivaires.

Les données d'au moins trois répétitions biologiques ont été utilisées pour calculer les médianes à des fins de représentation graphique. Les analyses statistiques ont utilisé le test de Mann-Whitney pour les groupes non apparentés et le test unilatéral de rang signé Wilcoxon pour paires appariées pour le même groupe avec un échantillonnage en série pour déterminer si les piqûres de moustiques augmentaient les IgG spécifiques d'AgTRIO par ELISA. La différence et les données ont été présentées sous forme de médiane avec intervalle interquartile (IQR). Une valeur de p <0,05 était considérée comme statistiquement significative. L'analyse, les graphiques et les statistiques de toutes les données ont été effectués à l'aide du logiciel Prism 9.0 (GraphPad Software).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données associées à cette étude sont présentes dans le document. Les demandes de ressources, de données et de réactifs doivent être adressées à l'auteur correspondant, le Dr Y.-MC ([email protected]). Tous les réactifs uniques décrits dans cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant avec un accord de transfert de matériel rempli.

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Nous remercions Kathleen DePonte et Ming-Jie Wu pour leur assistance technique. Ces études ont été soutenues par des subventions AI158615, AI142708 et AI145779 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et de l'Initiative sur les agents pathogènes émergents de l'Institut médical Howard Hughes.

Section des maladies infectieuses, Département de médecine interne, École de médecine de l'Université de Yale, New Haven, CT, États-Unis

Yu-Min Chuang, Selma Abouneameh, Hamidah Raduwan & Erol Fikrig

Institute for RNA Innovation and Department of Medicine, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis

Mohamad-Gabriel Alameh et Drew Weissman

L2 Diagnostics, LLC, New Haven, CT, États-Unis

Michel Ledizet

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Y.-MC et EF ont conceptualisé et conçu l'étude. Y.-MC, SA et HR ont planifié et effectué des immunisations d'animaux, y compris des saignées et des tests de protection. YM.C et SA ont effectué des tests ELISA. M.-GA et DW ont produit de l'ARNm, produit des LNP vides, encapsulé des ARNm dans des LNP et effectué une caractérisation physicochimique des LNP. Y.-MC, ML, DW et EF ont rédigé l'article avec l'aide de co-auteurs.

Correspondance avec Yu-Min Chuang.

EF détient une participation et agit en tant que consultant pour L2 Diagnostics. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Chuang, YM., Alameh, MG., Abouneameh, S. et al. Un vaccin à ARNm AgTRIO contre les moustiques contribue à l'immunité contre le paludisme. npj Vaccins 8, 88 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00679-x

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Reçu : 20 février 2023

Accepté : 16 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41541-023-00679-x

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