Réponses préférentielles des anticorps de lapin à C

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9156 (2023) Citer cet article

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Les anticorps produits chez des lapins immunisés contre des peptides sont utilisés dans la recherche biologique depuis des décennies. Bien que cette approche ait été largement mise en œuvre, des protéines spécifiques sont parfois difficiles à cibler pour de multiples raisons. Une considération qui a été notée chez les souris est que les réponses humorales peuvent cibler préférentiellement l'extrémité carboxyle de la séquence peptidique qui n'est pas présente dans la protéine intacte. Pour faire la lumière sur la fréquence des réponses préférentielles des anticorps de lapin aux extrémités C-terminales des immunogènes peptidiques, nous présentons notre expérience avec la génération d'anticorps de lapin contre le NOTCH3 humain. Un total de 23 anticorps ont été élevés contre 10 séquences peptidiques de NOTCH3 humain. Plus de 70 % (16 sur 23) de ces anticorps polyclonaux ont été déterminés comme étant C-terminaux préférant : les anticorps réactifs au peptide NOTCH3 ciblaient largement le groupe carboxyle libre terminal du peptide immunisant. Les anticorps qui préféraient les épitopes C-terminaux réagissaient faiblement ou pas du tout avec des séquences cibles recombinantes avec extension à l'extrémité C-terminale qui éliminait le groupe carboxyle libre de la structure immunogène ; de plus, chacun de ces antisérums n'a révélé aucune réactivité d'anticorps vis-à-vis des protéines tronquées avant l'extrémité C-terminale de l'immunogène. Dans les applications immunocytochimiques de ces anticorps anti-peptides, nous avons également trouvé une réactivité aux cibles recombinantes qui se lie le mieux aux cellules exprimant l'extrémité C-terminale libre de la séquence immunisante. Dans l'ensemble, notre expérience démontre une forte propension des lapins à monter des réponses anticorps aux épitopes C-terminaux des peptides dérivés de NOTCH3, ce qui devrait limiter leur utilisation contre la protéine native. Nous discutons de certaines approches potentielles pour surmonter ce biais qui pourraient améliorer l'efficacité de la génération d'anticorps dans ce paradigme expérimental couramment utilisé.

Le développement et l'application d'anticorps de recherche ont été indispensables à l'étude des protéines. Parmi les anticorps de recherche, les antisérums anti-peptides ont acquis une faveur significative, en grande partie grâce à l'élucidation d'un grand nombre de séquences génétiques codant pour des protéines et aux progrès technologiques dans la synthèse des peptides. Ces progrès permettent de produire des antisérums, généralement sans difficulté, en immunisant des animaux sans qu'il soit nécessaire de produire ou de purifier des cibles protéiques1,2.

Bien que largement couronnée de succès, l'immunisation anti-peptide échoue parfois à générer des anticorps utiles pour la détection des cibles protéiques1,3. Des échecs ont été attribués à l'incapacité de l'antigène peptidique à adopter la même conformation que la protéine cible4, à l'enfouissement de la séquence cible dans des régions inaccessibles5 ou à une modification post-traductionnelle de la protéine cible qui ne se reflète pas dans l'immunogène peptidique.

Dans une étude précédente, Liang et ses collègues6 ont noté une autre raison potentielle de l'échec à générer des anticorps anti-peptides utilisables : le ciblage préférentiel des anticorps sur l'extrémité carboxyle (C-terminale) des peptides immunisants qui n'est pas présente dans la protéine intacte. Ils ont rapporté que l'immunisation de souris avec un épitope interne de C-CAM1 produisait une réponse anticorps en grande partie à l'extrémité C-terminale du peptide immunisant ; les anticorps monoclonaux des souris ont réagi au peptide immunisant d'une manière dépendante de l'extrémité C-terminale de l'immunogène, mais ces anticorps ne se sont pas liés à la protéine intacte. Les chercheurs ont conclu que les anticorps monoclonaux dérivés de souris nécessitaient la fraction carboxylate présente dans l'extrémité C-terminale qui était éliminée par la liaison peptidique présente dans la protéine intacte.

Dans une autre étude, Edwards et ses collègues7 ont développé une approche réussie pour générer des anticorps contre des protéines bactériennes qui reposaient sur l'immunisation de lapins avec de petits peptides correspondant aux extrémités C-terminales de protéines individuelles. Cette étude a indiqué que les lapins étaient capables de générer des réponses efficaces aux extrémités C-terminales des peptides et que les anti-sérums générés contre les immunogènes courts étaient remarquablement spécifiques. La proportion relative d'anticorps qui préféraient les extrémités C-terminales des immunogènes peptidiques était élevée pour plusieurs anticorps rapportés, comme évalué par la compétition peptidique des dosages ELISA.

Dans la présente étude, nous interrogeons : (1) le degré auquel les réponses humorales anti-peptides ciblent préférentiellement l'extrémité C-terminale des séquences peptidiques humaines immunisantes chez des lapins individuels et (2) la fréquence des réponses humorales préférant l'extrémité C-terminale dans une série de lapins immunisés avec des peptides représentant des fragments d'une protéine humaine. Pour répondre à ces questions, nous avons rétrospectivement analysé les antisérums polyclonaux d'une série de projets visant à générer des anticorps NOTCH3, en nous concentrant sur la spécificité de chaque préparation d'anticorps pour l'extrémité C-terminale du peptide utilisé pour l'immunisation.

NOTCH3 est un récepteur transmembranaire (Fig. 1A) qui joue de multiples rôles dans le développement, l'homéostasie et la pathologie. Les mutations de NOTCH3 sont responsables de la cause la plus fréquente d'AVC héréditaire et de démence vasculaire, l'artériopathie cérébrale autosomique dominante avec infarctus sous-corticaux et leucoencéphalopathie (CADASIL)8,9.

Génération et caractérisation d'anticorps anti-peptide contre NOTCH3. (A) Positions des séquences NOTCH3 ciblées pour la production d'anticorps et les immunogènes peptidiques. Le haut montre une représentation schématique de la protéine NOTCH3 humaine, composée en grande partie de répétitions de type EGF en tandem à l'extrémité N-terminale. Les cercles représentent les positions des séquences peptidiques utilisées pour l'immunisation des lapins. Les séquences peptidiques correspondantes, les emplacements de répétition EGF (EGF #) et les numéros d'anticorps sont affichés ci-dessous. Des séquences de type sauvage ont été utilisées, à l'exception de deux peptides (correspondant aux anticorps 2076-2079) qui incluent des résidus de mutant CADASIL (en rouge). (B) Stratégie de caractérisation pour déterminer les antisérums de préférences cibles. Une explication détaillée de la caractérisation des anticorps 1495 et 1496 contre une séquence peptidique de l'EGF27 illustre l'approche employée pour déterminer la spécificité de séquence de tous les anticorps. La séquence immunogène (verte) a été clonée dans l'extrémité C-terminale de l'EGFP (GFP) pour diriger l'expression de 5 variants recombinants. Le clone 0 se termine précisément à l'extrémité C-terminale de l'immunogène. Le clone - 2 est une délétion de deux acides aminés du clone 0 ; Le clone - 1 est une délétion d'un acide aminé du clone 0 ; Le clone + 1 contient une extension d'acide aminé vers le clone 0 (de la séquence de type sauvage) ; et Clone + 2 contient deux acides aminés ajoutés au Clone 0). Les 5 recombinants et un clone EGFP sans aucune séquence NOTCH3 ont été exprimés dans des cellules HEK293, et les protéines recombinantes ont été analysées par immunotransfert (IB; voir Fig. 2, 3) et par immunocytochimie (ICC; voir Fig. 5) en utilisant les anticorps correspondants.

Au cours de nos travaux sur NOTCH3, nous avons découvert que NOTCH3 est clivé au niveau de deux séquences Asp-Pro près de l'extrémité N-terminale qui est améliorée dans CADASIL10,11. Ces découvertes ont nécessité la génération d'anticorps monoclonaux spécifiques aux néo-épitopes qui étaient spécifiques des résidus d'acide aspartique C-terminal générés par le clivage Asp-Pro. Ces anticorps sont spécifiques des séquences avec l'acide aspartique C-terminal ; l'extension de la protéine au-delà des résidus terminaux d'aspartate a éliminé la liaison10,11.

Nous avons également constaté au cours de ces études que les sérums polyclonaux de lapins immunisés qui ont servi à générer les anticorps contre les séquences terminales de l'aspartate étaient fortement enrichis en anticorps nécessitant l'aspartate C-terminal ; les sérums ne contenaient que de petites quantités d'anticorps capables de réagir à des séquences qui ne contenaient pas le résidu aspartate C-terminal. (Les données sont présentées dans le cadre de cette étude.) Cela nous a incités à mener l'étude actuelle pour déterminer la fréquence des réponses d'anticorps qui reconnaissent préférentiellement les séquences C-terminales d'une grande série d'anticorps NOTCH3 indépendants qui ont été préparés par immunisation peptidique de lapins. .

Les régions de NOTCH3 que nous avons ciblées pour la production d'anticorps sont présentées sur la figure 1A. Les anticorps ciblent tous l'ectodomaine de la protéine, la région qui est le site de la plupart des mutations de CADASIL et qui est composée de répétitions en tandem de type EGF12,13. Les répétitions de type EGF sont enrichies en résidus de cystéine, et tous les peptides comprennent au moins un résidu de cystéine. Les séquences de peptides utilisées sont présentées sur la figure 1B. Des peptides ont été utilisés pour immuniser de 2 à 4 lapins à la fois. Différents vendeurs ont mené les expériences10,11,14 et les immunisations ont été réalisées à l'aide de peptides conjugués à la KLH dont la pureté a été vérifiée par spectroscopie de masse.

Les lapins ont été immunisés conformément aux calendriers qui ont été standardisés par le fournisseur sous contrat pour fabriquer les anticorps. Dans tous les cas, les sérums pré-immuns ont présenté une réactivité minimale aux immunogènes et à la fin du programme d'immunisation, chaque animal a produit un sérum positif par ELISA à une dilution supérieure à 1:512 000, indiquant une forte réponse humorale à l'immunisation.

Les sérums ont été purifiés par affinité en utilisant des colonnes générées par la réticulation du peptide aux billes. Des méthodes standard ont été utilisées, y compris le lavage avec des milieux et l'élution à l'aide d'un tampon acide qui a ensuite été dialysé contre du PBS neutre avant que les préparations d'anticorps ne soient congelées après stabilisation avec 20 % de glycérol. La réactivité des préparations finales d'anticorps polyclonaux a été vérifiée par ELISA.

La spécificité de chaque séquence cible d'anticorps NOTCH3 a été déterminée en sondant des immunotransferts de GFP recombinante fusionnée à des séquences peptidiques de longueurs différentes ; nous illustrons la stratégie dans un exemple illustré à la Fig. 1B. Des clones génétiques de GFP ont été fusionnés avec des séquences d'ADN codant pour la séquence d'acides aminés de chaque peptide immunisant (appelé Clone 0 pour chaque anticorps). Un ou deux acides aminés ont été supprimés de la cible peptidique pour générer les clones - 1 et - 2. De plus, un ou deux acides aminés de la séquence de la protéine NOTCH3 ont été ajoutés pour générer les clones + 1 et + 2. Un exemple de clones GFP générés pour tester les séquences cibles des anticorps 1495 et 1496 est illustré sur la figure 1B. L'expression de l'ADNc Les clones - 2, - 1, 0, + 1 et + 2 ont été transfectés dans des cellules pour générer des lysats de protéines contenant des protéines GFP de fusion et séparés sur des Western blots. Les transferts ont été sondés avec des antisérums NOTCH3 et des anticorps GFP. Par la suite, le rapport du signal de l'anticorps NOTCH3 à la GFP a été pris comme mesure de l'affinité de l'anticorps NOTCH3. Si les anticorps réagissent préférentiellement contre l'extrémité C-terminale du peptide immunisant, on observera le signal de liaison le plus élevé à la protéine de fusion GFP du clone 0, avec des signaux plus faibles pour les protéines de fusion GFP des clones - 2, - 1, + 1, et + 2.

L'analyse par immunotransfert utilisant des anticorps NOTCH3 est illustrée sur les Fig. 2, 3 et Fig. supplémentaires. 1, 2. Une grande partie des anticorps ont réagi aux protéines contenant l'extrémité carboxyle du peptide immunisant, avec une quantité beaucoup plus faible d'anticorps se liant aux protéines dépourvues du résidu carboxyle (clones − 2 et − 1) et aux protéines avec amino des extensions acides qui bloquent le résidu carboxylique du peptide (clones + 1 et + 2).

Analyse par immunotransfert de la préférence de cible des anticorps anti-peptide NOTCH3. L'analyse par immunotransfert des lysats protéiques de cellules transfectées avec des fusions GFP avec des résidus C-terminaux variables est présentée (A – K). Pour chacun de ces blots, HEK293 ont été transfectés avec 6 plasmides dirigeant l'expression de l'EGFP sans séquences NOTCH3 (GFP) ou avec une séquence immunogène complète (Clone 0) ou des délétions (- 2 et - 1) ou des ajouts (+ 1 ou + 2) (voir Fig. 1B) qui correspondent à l'anticorps répertorié (voir le numéro d'anticorps à côté du blot inférieur de chaque panneau). Les séquences utilisées pour l'immunisation sont codées par des cercles correspondant à la figure 1A. Les transferts ont été sondés pour les anticorps GFP (transfert supérieur) et NOTCH3 (transfert inférieur) et le rapport signal inférieur/supérieur a été déterminé. Toutes les valeurs ont été normalisées à la GFP. Deux contrôles GFP différents ont été utilisés qui contenaient des extensions C-terminales non-NOTCH3 de tailles différentes. (L) Une représentation schématique des protéines produites par transfection montrant que pour chaque séquence cible, le clone 0 contient l'immunogène utilisé (se terminant par un résidu représenté par le losange rouge), tandis que d'autres clones contiennent des délétions ou des extensions (losanges violets et bleus). Le clone 0 dans chaque panel génère le plus de signal si un anticorps cible préférentiellement l'extrémité C-terminale de l'immunogène. Des expériences d'immunoblot ont été effectuées au moins trois fois pour chaque anticorps. La signification avec p < 0,05 par rapport au clone 0 est indiquée par un astérisque noir (ANOVA unidirectionnelle pour les données normales) et un astérisque rouge (test de Kruskal-Wallis pour les données non paramétriques). Les gels pleine longueur sont illustrés dans les figures supplémentaires. 3, 4.

Analyse immunoblot supplémentaire de la préférence de cible des anticorps anti-peptide NOTCH3. Veuillez vous référer à la figure 2 ; des anticorps supplémentaires ont été évalués de la même manière dans (A–L). Comme précédemment, les expériences ont été réalisées au moins trois fois pour chaque anticorps. Les gels pleine longueur sont illustrés dans les figures supplémentaires. 3, 4. La signification avec p < 0,05 par rapport au clone 0 est indiquée par un astérisque noir (ANOVA unidirectionnelle pour les données normales) et un astérisque rouge (test de Kruskal-Wallis pour les données non paramétriques).

Il convient de noter qu'il y avait une très forte concordance de la préférence spécifique C-terminale parmi les anticorps qui ont été produits après immunisation avec une séquence peptidique donnée. Les séquences qui ont généré des préférences C-terminales l'ont fait chez 100 % des lapins immunisés ; dans le cas d'EGF2C, les 6 lapins ont démontré qualitativement des réponses humorales ciblant les épitopes C-terminaux (Figs. 2H – K et 3A, B). Les peptides qui ont généré des anticorps avec une préférence C-terminale atténuée ont généré des préférences similaires chez chaque lapin testé (par exemple EGF1N (Fig. 2A, B) et EGF13 (Fig. 3E, F)). La concordance de la préférence C-terminale est cohérente avec la conservation des réponses humorales entre les individus qui dépend de la séquence peptidique utilisée pour l'immunisation.

Un grand nombre de peptides utilisés pour générer des anticorps terminés par des résidus d'aspartate. Afin de vérifier que les anticorps nécessitaient des résidus uniques en plus de l'aspartate terminal, nous avons effectué un immunotransfert sur toutes les protéines du clone 0 se terminant par l'acide aspartique en utilisant des anticorps dirigés contre les séquences d'acide aspartique C-terminal. Bien que certains anticorps aient eu une très faible réactivité croisée contre des épitopes qui n'ont pas été utilisés pour l'immunisation, neuf des neuf anticorps étaient les plus avides pour les séquences NOTCH3 utilisées pour l'immunisation lorsqu'ils ont été testés contre des panels de fusions GFP-NOTCH3. La figure 4 illustre quatre anticorps qui étaient hautement spécifiques pour la séquence immunisante sur des immunotransferts.

Spécificité des anticorps qui ciblent préférentiellement l'extrémité C-terminale des peptides NOTCH3. Une analyse par immunoblots utilisant les anticorps polyclonaux 5210 (A), 4944 (B), 1415 (C) et 1496 (D) a été réalisée pour déterminer la spécificité de chaque anticorps contre neuf séquences NOTCH3 indépendantes. L'identité de chaque protéine est indiquée au-dessus des lignes des transferts ; la piste 1 est un contrôle négatif GFP non-NOTCH3 ; d'autres lignes représentent le clone 0 à partir des séquences représentées sur la figure 1 (les marquages ont été abrégés pour plus de clarté ; voir la figure 1A, EGF#). Chaque panneau montre le sondage pour GFP (transfert supérieur) par rapport au sondage avec les anticorps NOTCH3 (transfert inférieur de chaque paire). Les gels pleine longueur sont présentés dans la Fig. 5 supplémentaire.

Nous avons également évalué la préférence C-terminale des anticorps NOTCH3 par coloration cellulaire pour les protéines exprimées en culture cellulaire. Des cultures cellulaires ont été transfectées avec des constructions d'expression utilisées dans les Fig. 2, 3. Après avoir fixé les cellules transfectées, nous avons effectué une immunocytochimie en utilisant des anticorps apparentés. On s'attendait à ce que les anticorps avec une préférence C-terminale montrent une forte coloration des cellules transfectées avec le clone 0 mais pas les clones − 2, − 1, + 1 ou + 2. En général, il y avait une bonne correspondance entre la préférence C-terminale évaluée par immunotransfert et Préférence C-terminale évaluée par immunocytochimie. Par exemple, sur la Fig. 5, nous montrons la coloration des anticorps 4143, 9932 et 1415 de cellules transfectées avec une série de clones contenant son peptide cible (clone 0 ; Fig. 5) et des délétions ou des additions (clones - 1 et + 1 ; figure 5). La coloration cellulaire était la plus forte avec le clone 0 et non présente au-dessus du bruit de fond pour les clones - 1 ou + 1. Ce modèle correspond aux préférences de réactivité par immunotransfert Plusieurs anticorps ont généré une coloration de fond élevée pour les cellules non transfectées et tous les groupes transfectés, ce qui a rendu impossible évaluer la préférence C-terminale. L'anticorps 8274 a montré une coloration pour les cellules exprimant les clones - 1, 0 et + 1 (ligne 5; Fig. 5) qui correspondaient aux résultats d'immunoblot montrant que cet anticorps présentait une liaison C-terminale non exclusive.

Préférences de site des anticorps anti-peptide NOTCH3 par analyse immunocytochimique. Les cellules HEK293 ont été transfectées de manière transitoire avec des constructions recombinantes correspondant aux marqueurs supérieurs. Chaque ensemble de cellules transfectées a été coloré avec des anticorps sur la gauche. GFP-Clone-1 correspond à la GFP fusionnée à la séquence peptidique immunisante correspondante avec une délétion d'acide aminé. GFP-Clone 0 est la fusion GFP à la séquence immunogène (appariée à l'extrémité C-terminale à la séquence peptidique de la figure 1A). GFP-Clone + 1 contient un acide aminé supplémentaire. Tous les recombinants GFP avec des séquences NOTCH3 comprennent des séquences utilisées pour l'immunisation (comme le montre la figure 1A). Par exemple, des cellules sondées avec 4143 ont été transfectées avec des constructions se terminant par des séquences de EGF2(C) : SCRCPRGFRGPDCSLP, SCRCPRGFRGPDCSLPD et SCRCPRGFRGPDCSLPDP.

Des travaux antérieurs ont montré que le biais en faveur des réponses immunitaires humorales chez la souris à l'extrémité C-terminale des peptides pourrait limiter la diversité et l'utilité des anticorps6. Ici, nous décrivons les résultats d'une série de 23 immunisations de lapin avec 10 peptides différents. Nous démontrons qu'une grande majorité d'antisérums issus de ces immunisations génèrent des anticorps qui réagissent principalement aux séquences C-terminales du peptide aux dépens d'anticorps qui sont indépendants de l'extrémité C-terminale de l'immunogène. Nous montrons également que la préférence de l'épitope C-terminal est similaire entre les lapins individuels et dépend de la séquence peptidique.

Il s'agit de la plus grande étude à notre connaissance qui démontre une forte préférence pour la réponse humorale chez les lapins pour cibler les terminaisons C des séquences peptidiques humaines. Les résultats sont cohérents avec l'étude d'Edwards qui a rapporté un taux très efficace de production d'anticorps ciblant une classe de protéines d'intérêt lorsque des séquences peptidiques C-terminales ont été utilisées pour l'immunisation7. Les anticorps polyclonaux antérieurs dirigés contre des peptides se terminant par de l'aspartate étaient principalement composés d'anticorps qui réagissent contre les terminaisons C des immunogènes peptidiques, permettant la détection de néo-épitopes générés par la caspase15,16. Il semble probable, sur la base des travaux collectifs, qu'une approche de génération de réactifs contre les protéines de mammifères puisse utiliser un biais pour que le système immunitaire des lapins génère des anticorps C-terminaux.

Une augmentation du nombre d'anticorps monoclonaux de lapin, stimulée par la disponibilité de flux de travail rapides qui facilitent la génération d'anticorps, y compris les technologies de clonage des cellules B, souligne l'importance de ces observations. Le nombre de clones devant être criblés pour générer des anticorps réussis pourrait être élevé si les peptides utilisés pour l'inoculation provoquent des réponses spécifiques C-terminales. Il est possible que l'efficacité des futurs projets monoclonaux de lapin puisse être augmentée en générant des anticorps contre l'extrémité C-terminale native des protéines, comme suggéré par Edwards et al.7.

Les résultats peuvent-ils être généralisés ? Un facteur qui nous donne confiance est que nous avons examiné plusieurs séquences peptidiques en tant qu'immunogènes. De plus, l'étude ne reposait pas sur l'utilisation d'une seule installation pour produire des anticorps ; la génération d'anticorps a été sous-traitée à des parties qui n'étaient pas impliquées dans l'analyse des sérums. De plus, le projet a été réalisé sur une longue fenêtre temporelle. Enfin, nous avons pu confirmer la préférence C-terminale des anticorps en utilisant deux méthodes différentes dans la plupart des cas.

Néanmoins, il est possible que la préférence observée pour les C-terminaux soit surestimée. Une limite de ce rapport est sa nature rétrospective qui a analysé les sérums obtenus dans le cadre de plusieurs projets indépendants non conçus pour tester l'hypothèse de ce rapport. Les peptides utilisés dans cette étude étaient tous dérivés d'une seule protéine extracellulaire. NOTCH3 peut être moins immunogène que d'autres protéines car il peut circuler naturellement17 et parce que les homologues de mammifères sont bien conservés. En fait, la plupart des peptides humains utilisés pour l'immunisation sont presque identiques aux séquences de lapin. Il existe des différences d'un seul résidu dans les peptides utilisés pour les anticorps 2076–2079, 9931, 9932, 1412 et 1413 et deux différences d'acides aminés pour les anticorps 1495–1496. La moitié restante des peptides humains sont identiques aux séquences de lapin.

En tant qu'enquête pragmatique, nous n'avons pas effectué d'analyse mutationnelle ou de modification biochimique des peptides qui permettrait des détails plus fins de la préférence C-terminale. Les séquences choisies pour cette étude n'étaient pas exemptes de cystéine, car NOTCH3 est une protéine riche en cystéine. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la préférence C-terminale soit motivée par la teneur élevée en cystéine des peptides qui peuvent forcer les protéines dans des conformations spécifiques qui biaisent la réponse humorale. De futures études avec un examen approfondi des titres C-terminaux pourraient être envisagées, en particulier si elles sont initiées par plusieurs chercheurs ou fabricants d'anticorps à l'échelle industrielle susceptibles de produire des données à une échelle beaucoup plus grande que cette étude. Une telle base de données permettrait une meilleure compréhension des catégories spécifiques de séquences qui sont plus susceptibles de générer une réactivité C-terminale.

Indépendamment de la généralisabilité, il est clair que la préférence C-terminale des réponses d'anticorps chez les lapins se produit ; conformément, la diminution de la quantité relative d'anticorps C-terminaux peut améliorer l'efficacité de la génération d'anticorps. À l'avenir, plusieurs méthodes peuvent être testées pour bloquer l'extrémité C-terminale, notamment (1) l'utilisation de peptides cycliques ; (2) blocage chimique de l'extrémité C-terminale des peptides par estérification ; (3) purification par affinité à l'aide de peptides conjugués par l'extrémité C-terminale ou avec des extrémités C-terminales bloquées ; (4) des stratégies pour empêcher la réactivité des résidus de cystéine qui peuvent cacher des régions immunogènes importantes pour la reconnaissance du milieu des peptides ; et (5) l'utilisation d'adjuvants alternatifs ou d'un dosage d'adjuvant agressif qui pourrait aider à surmonter la tolérance aux épitopes conservés au cœur des peptides. Il convient de noter que Liang et al.6 ont amidé l'extrémité C-terminale des séquences C-CAM1 et n'ont pas trouvé que cela augmentait la tendance des souris à produire des anticorps reconnaissant la protéine cible intacte ; au lieu de cela, ils ont suggéré le criblage d'anticorps monoclonaux contre un peptide plus long à extension C-terminale en tant qu'immunogène, suivi de l'utilisation d'un peptide court pour le criblage (ou dans ce cas la purification par affinité). En ce qui concerne l'alkylation de la cystéine pour bloquer les peptides riches en cystéine de la réticulation chimique, cela pourrait être tenté, mais il a été démontré que ses effets sont atténués car les cystéines alkylées peuvent elles-mêmes devenir la cible de réponses anticorps18,19. Un point de départ naturel pour tester l'effet des adjuvants serait d'utiliser des alternatives à l'adjuvant complet de Freund, qui a été utilisé pour tous les animaux de cette étude.

Nous concluons que la préférence C-terminale des réponses d'anticorps peut être une caractéristique commune de la production d'anticorps anti-peptide ; cela doit être considéré comme une cause possible de l'échec de la génération d'anticorps dirigés contre des cibles protéiques natives.

Des anticorps polyclonaux de lapin ont été générés par des vendeurs commerciaux en utilisant des procédures standard qui sont détaillées ailleurs10,11,14. Toutes les expérimentations animales ont été examinées et approuvées par les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de GenScript et Cocalico Biologics) et réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes, y compris les recommandations du panel sur l'euthanasie de l'American Veterinary Medical Association et ARRIVE directives (un groupe témoin d'animaux non immunisés contre les peptides n'a pas été inclus car cela n'est pas nécessaire pour la production d'anticorps). Des antigènes peptidiques ont été synthétisés correspondant aux résidus de la protéine NOTCH3 humaine illustrée sur la figure 1 (séquences de Accession : NP_000426.2 GI : 134244285). Les antigènes ont été réticulés à KLH avant l'immunisation, qui a été réalisée avec un adjuvant de Freund complet pour l'immunisation primaire et avec un adjuvant de Freund incomplet pour les rappels ultérieurs. Tous les animaux auxquels ont été injectés les antigènes peptidiques décrits ont été inclus dans l'étude. Les saignements de test ont été analysés par les fournisseurs en fonction de leur flux de travail standardisé. Le sérum des hémorragies terminales a été utilisé pour l'évaluation des profils de réactivité dans la présente étude.

Des oligonucléotides double brin codant pour des épitopes cibles ont été insérés dans l'extrémité C-terminale du cadre de lecture ouvert de l'EGFP par des procédures de ligature standard avec pEGFP-C3 (Clontech); toutes les constructions ont été séquencées pour valider la présence d'un cadre de lecture ouvert continu. Comme témoins, EGFP-C1 ou EGFP avec une extension C-terminale non pertinente ont été utilisés pour mesurer la réactivité de fond à la protéine EGFP. L'utilisation de deux contrôles négatifs a généré des produits de tailles différentes, observés dans différents panels d'immunoblot (par exemple, Fig. 2A – H vs Fig. 2I, K).

Nous avons utilisé des méthodes issues de travaux décrits précédemment14,18. Les protéines ont été résolues sur des gels de polyacrylamide SDS ; ils ont ensuite été transférés sur nitrocellulose avec un instrument iBlot 2 (Invitrogen, méthode P0 20 V pendant 1 min/23 V pendant 4 min/25 V pendant 2 min) ; les membranes de nitrocellulose ont été bloquées à l'aide de TBST avec du lait à 5 %, puis sondées avec des anticorps primaires dans du TBST pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps primaires ont été utilisés à une dilution de 1:1000 à partir de sérums purifiés par affinité. Des anticorps secondaires dans du TBST ont été appliqués à température ambiante pendant 30 min. Le lavage après les incubations d'anticorps a été effectué trois fois en utilisant du TBST à température ambiante. Les préparations d'anticorps secondaires utilisées comprenaient l'IRDye 680RD anti-souris d'âne (Li-Cor #926-68072, dilution 1:10 000, AB_10953628) et l'IRDye 800CW anti-lapin de chèvre (Li-Cor #926-32211, dilution 1:10 000, AB_2651127) . Un imageur Li-Cor Odyssey avec des paramètres de détection à 700 nm et 800 nm et le logiciel Li-Core Image Studio ont été utilisés pour la capture et la quantification des données. Les immunotransferts pleine longueur sont affichés dans les figures supplémentaires. 3–5.

Les cellules HEK293 cultivées ont été cultivées dans du DMEM et du sérum bovin fœtal à 10 %. L'immunocytochimie a été réalisée sur ces cellules après qu'elles aient été transfectées avec des plasmides EGFP en utilisant PolyJet (SignaGen, cat # SL100688) selon le protocole recommandé par le fabricant20. Après une nuit d'incubation, les cellules ont été fixées avec du formol. Les cellules ont été incubées dans une solution de blocage (2 % de BSA dans du PBS) pendant 30 min et un anticorps primaire (1 : 200 pour les anticorps GFP et 1 : 500 pour les sérums purifiés par affinité) a été appliqué pendant 2 à 4 h à température ambiante. Des anticorps secondaires biotinylés dans une solution de blocage à une dilution de 1:200 ont été appliqués pendant 30 min suivis d'une incubation de 15 min de la solution ABC préparée selon le protocole du fabricant (kit Vectastain Elite ABC, Vector Lab, cat # NC9293436). Enfin, l'incubation DAB pour la réaction colorée a été appliquée pendant 1 à 5 min avec le kit ImmPACT DAB HRP Substrate (Vector Lab, cat # NC9567138); toutes les étapes de lavage ont été effectuées avec du PBS, trois à cinq fois ; les cellules n'ont pas été contre-colorées. Des transfections répliquées ont également été colorées pour la GFP (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology).

Les ensembles de données ont été analysés pour la normalité à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Pour les données normalement distribuées, les comparaisons ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Dunnet pour les comparaisons multiples. Pour l'analyse non paramétrique, les tests de Kruskal-Wallis suivis de l'analyse post hoc de comparaison multiple de Dunn ont été utilisés pour comparer les différences entre les groupes (logiciel d'analyse Prism 8). Une valeur de probabilité < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nos études sont soutenues par des subventions du NIH (NS099160) et du Department of Veterans Affairs (BX003855 et BX003824).

Département de neurologie, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, États-Unis

Soo Jung Lee, Mitchell B. Gasche, Connor J. Burrows, Akhil Kondepudi, Xiaojie Zhang et Michael M. Wang

Département de physiologie moléculaire et intégrative, Université du Michigan, 7725 Medical Science Building II Box 5622, 1137 Catherine St., Ann Arbor, MI, 48109-5622, États-Unis

Michael M. Wang

Service de neurologie, Département des anciens combattants, VA Ann Arbor Healthcare System, Ann Arbor, MI, 48105, États-Unis

Soo Jung Lee, Xiaojie Zhang et Michael M. Wang

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SJL a conçu l'étude, réalisé des expériences, analysé les données, préparé les figures, révisé le manuscrit. MBG a réalisé des expériences, analysé les données, préparé les figures, révisé le manuscrit. CJB a réalisé des expériences, revu le manuscrit. AK a effectué des expériences, a examiné le manuscrit. XJ a analysé les données, revu le manuscrit. MMW a conçu l'étude, analysé les données, préparé les chiffres, rédigé le manuscrit.

Correspondance à Michael M. Wang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lee, SJ, Gasche, MB, Burrows, CJ et al. Réponses préférentielles des anticorps de lapin aux extrémités C-terminales des immunogènes peptidiques NOTCH3. Sci Rep 13, 9156 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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Reçu : 03 février 2023

Accepté : 29 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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