La microglie humaine montre des changements transcriptionnels uniques dans la maladie d'Alzheimer

Nature Aging (2023)Citer cet article

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La microglie, les cellules immunitaires innées du cerveau, influence la progression de la maladie d'Alzheimer (MA) et sont des cibles thérapeutiques potentielles. Cependant, la microglie présente des fonctions diverses, dont la régulation n'est pas entièrement comprise, compliquant le développement thérapeutique. Pour mieux définir les phénotypes transcriptomiques et les réseaux de régulation génique associés à la MA, nous avons enrichi les noyaux de la microglie de 12 AD et 10 cortex préfrontal dorsolatéral humain témoin (7 hommes et 15 femmes, tous âgés de plus de 60 ans) avant le séquençage de l'ARN à noyau unique. Ici, nous décrivons à la fois les phénotypes moléculaires microgliaux établis et non reconnus, les réseaux de gènes inférés entraînant le changement transcriptomique observé, et appliquons une analyse de trajectoire pour révéler les relations putatives entre les phénotypes microgliaux. Nous identifions les phénotypes microgliaux plus répandus dans les cas de MA par rapport aux témoins. En outre, nous décrivons l'hétérogénéité des sous-grappes de microglie exprimant des marqueurs homéostatiques. Notre étude démontre que le profilage profond de la microglie dans le cerveau humain atteint de MA peut donner un aperçu des changements transcriptionnels microgliaux associés à la MA.

La maladie d'Alzheimer (MA) est pathologiquement caractérisée par des plaques extracellulaires de bêta-amyloïde (Aβ), des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires neuronaux et une neuroinflammation. L'intérêt pour la neuroinflammation en tant que caractéristique modifiable de la pathologie de la MA s'est accru en conjonction avec des études génétiques identifiant des variants de risque de MA localisés dans les régions codantes et non codantes des gènes exprimés de manière unique par les cellules myéloïdes du cerveau1. Les microglies sont des cellules myéloïdes immunitaires innées résidentes du cerveau et contribuent aux processus neuro-inflammatoires supposés favoriser la physiopathologie de la MA2,3,4,5,6,7,8,9,10. Des études antérieures ont suggéré que, dans la MA, la microglie libère des médiateurs inflammatoires qui influencent le comportement et la fonction des neurones environnants, et que la glie perd ses fonctions neuroprotectrices et initie une phagocytose aberrante des synapses et des neurones3,7,11,12. La microglie semble contribuer à la propagation de tau dans les systèmes modèles13,14 et est probablement le principal type de cellule impliqué dans l'élimination de l'Aβ, y compris la réduction de l'Aβ observée en réponse aux approches d'immunothérapie à base d'anticorps15. En tant que tels, les comportements inflammatoires de la microglie sont pertinents pour la conception de cibles thérapeutiques. Cependant, de grandes lacunes subsistent dans notre compréhension des réponses de la microglie dans le cerveau AD.

Les phénotypes de la microglie sont différenciés par la morphologie, la physiologie et les modèles d'expression des gènes ou des protéines. Les expériences réalisées dans des systèmes modèles suggèrent que ces caractéristiques hétérogènes sont susceptibles d'être associées à des phénotypes fonctionnels spécifiques de la microglie10,16,17,18,19,20,21. On en sait moins sur l'hétérogénéité des phénotypes de la microglie dans le cerveau humain adulte, en particulier dans le cadre d'états pathologiques spécifiques, tels que la MA. Des études de séquençage d'ARN à cellule unique et à noyau unique (snRNA-seq) de tissus corticaux humains frais et congelés ont révélé de multiples phénotypes transcriptionnels de la microglie dans le contexte de la MA et d'autres pathologies cérébrales22,23,24,25,26,27,28, 29. La distinction de clusters transcriptomiquement distincts permet l'identification de facteurs génétiques et épigénétiques candidats régulant des comportements cellulaires spécifiques, qui pourraient être exploités dans des approches thérapeutiques de précision. Cependant, les méthodes standard de snRNA-seq incluent souvent un petit nombre de microglies par individu. Un faible nombre de cellules peut diminuer la capacité à cartographier la gamme complète des phénotypes transcriptionnels microgliaux et limiter la capacité à identifier les changements d'expression génique associés à la maladie au sein d'un cluster ou d'un sous-cluster. Nous avons émis l'hypothèse que des processus cellulaires supplémentaires et des facteurs de régulation des phénotypes transcriptionnels de la microglie seraient découverts en utilisant des ensembles de données contenant un nombre beaucoup plus important de microglies par échantillon individuel.

Nous avons utilisé le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) pour PU.1 comme technique d'enrichissement de la microglie pour le snRNA-seq. Le marqueur myéloïde PU.1 a été utilisé pour améliorer l'étude de l'épigénétique de la microglie à l'aide d'un dosage de la chromatine accessible à la transposase à l'aide du séquençage30 et, dans la présente étude, il a été appliqué au séquençage de l'ARN (ARN-seq). Cette approche a facilité l'acquisition de profils de transcriptome à noyau unique à partir de milliers de microglies par sujet. Nous avons généré des profils transcriptionnels de microglie à partir d'une cohorte de 22 individus avec et sans AD, nous permettant d'annoter des grappes de microglie avec des rôles biologiques plausibles et d'identifier les différences de microglie entre AD et les individus témoins. Le grand nombre de profils dans cet ensemble de données nous a également permis d'identifier des sous-clusters spécifiques à la MA dans le cluster de microglie généralement annotés comme "homéostatiques" en fonction de son profil d'expression génique22,25,26,29. En plus des phénotypes homéostatiques et inflammatoires décrits dans les rapports précédents, nous avons découvert des phénotypes microgliaux avec des profils transcriptomiques qui peuvent donner un aperçu supplémentaire de la pathogenèse de la MA. Ces découvertes fournissent de nouvelles pistes pour tester des hypothèses dans de futures études sur les rôles de la microglie dans la MA.

Nous avons enrichi des noyaux isolés de cerveau humain post-mortem pour la microglie à l'aide de FANS pour l'expression du facteur de transcription spécifique à la myéloïde PU.1 (Extended Data Fig. 1a, b). Pour confirmer que PU.1 FANS était efficace, nous avons isolé et séquencé des noyaux avec et sans PU.1 FANS (n = 4). Nous avons analysé des nombres similaires de noyaux totaux dans les ensembles de données non triés (46 085; Données étendues Fig. 1c) et PU.1 triés (41 488; Données étendues Fig. 1d). L'ensemble de données trié PU.1 contenait 20 fois plus de noyaux de microglie définis par une expression élevée de C3, CD74, C1QB, CX3CR1 et SPI1 (23 310 noyaux de microglie) que l'ensemble de données non trié (1 032 noyaux de microglie). Les noyaux de microglie observés dans l'ensemble de données trié PU.1 démontrent également une complexité supplémentaire, comme en témoignent davantage de grappes de microglie (données étendues Fig. 1d).

Nous avons ensuite appliqué PU.1 FANS à une cohorte de 22 individus (Fig. 1a). Après PU.1 FANS, les échantillons conservent une variété de types de cellules non myéloïdes (Fig. 1b) tout en fournissant une résolution claire des grappes démontrant des modèles d'expression distincts des gènes de la microglie (63 % des noyaux ; Fig. 1c). L'ensemble de données initial se composait de 205 226 noyaux, dont 200 948 noyaux (98 %) passant le contrôle de qualité et l'élimination des doublets. L'expression génique des gènes marqueurs de type cellulaire démontre que les groupes identifiés comme microglie (1, 2, 3, 7, 16 et 17; Fig. 1d) dans l'ensemble de données ont une expression élevée des marqueurs de la microglie et n'expriment pas les gènes marqueurs canoniques d'autres types de cellules . Ainsi, sur les 200 948 noyaux, 127 371 ont été identifiés comme des microglies (Fig. 1d et Extended Data Fig. 2), avec une moyenne de 5 790 noyaux par individu. Cet ensemble de données est le plus grand ensemble de données sur la microglie par échantillon généré jusqu'à présent, y compris par rapport à d'autres ensembles de données publiés qui ont utilisé des techniques d'enrichissement alternatives. Les tracés détaillés de l'expression génique de la microglie (données étendues Fig. 2) et des marqueurs d'astrocytes ou de monocytes périphériques (données étendues Fig. 3) démontrent une expression élevée des gènes de la microglie dans l'ensemble de données du sous-ensemble de microglie dans tous les sous-groupes et l'absence d'autres types de cellules et périphérique Marqueurs.

a, Conception expérimentale de 22 cortex préfrontaux dorsolatéraux humains post-mortem (créés en partie avec BioRender). b, UMAP des noyaux triés PU.1 de l'ensemble de données de 22 sujets démontre que, bien que d'autres types de cellules, y compris les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes (Oligs) et leurs progéniteurs (OPC) ainsi que les cellules endothéliales, sont présents, six clusters , dont les trois plus grands, sont composés de noyaux de microglie. c, les gènes marqueurs de type cellulaire représentatifs (axe x) avec le pourcentage de noyaux qui expriment un gène (taille du point) dans chaque groupe (répartis le long de l'axe y) et le niveau d'expression moyen (intensité de la couleur) sont indiqués pour la microglie (CX3CR1 , C1QB, CD74 et C3), astrocytes (GFAP), neurones (MAP2), OPC (COL20A1), Oligs (ST18) et cellules endothéliales (ITIH5) pour chaque cluster. d, L'expression génique d'un ensemble plus large de gènes marqueurs de type cellulaire démontre que les groupes 1, 2, 3, 7, 16 et 17 sont composés de microglie. IHC, immunohistochimie.

L'analyse de cluster des 127 371 noyaux avec une expression de type microglie a identifié 10 clusters (Fig. 2a) caractérisés par des gènes exprimés de manière différentielle (DEG) comparant le cluster à tous les autres noyaux (Fig. 2b). À l'aide de l'analyse d'enrichissement d'ensembles de gènes (GSEA), nous avons déterminé l'enrichissement des voies biologiques dans chaque groupe (Fig. 2c). Il y avait peu ou pas de chevauchement dans les DEG définissant chaque cluster ou les voies biologiques identifiées par GSEA, soutenant le caractère unique de chaque cluster.

a, UMAP de regroupement non biaisé sur les noyaux des six groupes triés PU.1 (1, 2, 3, 7, 16 et 17, illustrés à la Fig. 1d) répondant aux critères de la microglie de l'ensemble de données de 22 échantillons contient 10 groupes de microglie . b, l'analyse de l'expression différentielle comparant chaque cluster à tous les autres clusters démontre des profils d'expression génique distincts pour chacun. Les 25 meilleurs gènes de chaque groupe sont affichés avec les noms de gènes annotés sur la droite. Le groupe 1 est élevé dans l'expression des gènes canoniques de la microglie (CX3CR1 et P2RY12). c, l'analyse GSEA des gènes qui différencient chaque groupe du groupe 1 («marqueur homéostatique») suggère des voies biologiques distinctes. d, l'expression canonique du gène marqueur de la microglie dans l'ensemble de données sur la microglie par rapport à d'autres types de cellules triés pendant l'enrichissement PU.1 démontre l'enrichissement de l'expression du gène marqueur de la microglie dans les 10 grappes. NES, score d'enrichissement normalisé.

Tout d'abord, nous avons trouvé des clusters avec des annotations similaires aux phénotypes de microglie précédemment décrits dans le cerveau humain. Nous avons identifié le cluster 1, le plus grand cluster, comme le cluster enrichi en gènes homéostatiques, y compris une expression élevée de CX3CR1 et P2RY12 (réfs. 19, 24, 25, 26). Nous avons abrégé ce cluster exprimant un marqueur homéostatique en « HM ». HM a été établi comme base de comparaison pour évaluer les DEG pour d'autres clusters, reproduisant l'approche dans les publications précédentes22,25,26 (Données supplémentaires 1). Le cluster 4 a été enrichi pour les voies impliquées dans l'apoptose, la réponse à l'interféron gamma (IFN-γ) et les fonctions mitochondriales et respiratoires (Fig. 2c), y compris les voies KEGG de la maladie d'Alzheimer, de Parkinson et de Huntington. Le plus fortement DEG dans ce cluster est FTL. Pris ensemble, le profil du groupe 4 est évocateur d'un phénotype dégénératif ou dystrophique12,26. Le groupe 7 était caractérisé par l'expression de gènes impliqués dans la migration et la motilité (Fig. 2b). Les voies enrichies dans le groupe 7 comprenaient l'organisation membranaire et la motilité (Fig. 2c). Le groupe 8 présentait un phénotype inflammatoire canonique avec l'expression de gènes d'activation inflammatoire classiques, notamment NFκB1, RELB et IL1β (Fig. 2b) 2, 31, 32. La GSEA a révélé que ce groupe était enrichi en signalisation NFκB, en signalisation par interféron, en signalisation du récepteur de type Toll (TLR) et en voies de signalisation médiées par RIG-I, indiquant des réponses inflammatoires effectrices en aval aux stimuli (Fig. 2c). Les termes supplémentaires de Gene Ontology (GO) associés au groupe 8 comprenaient la synthèse et la localisation des lipides. Le groupe 9 est défini par les gènes et les voies impliqués dans la sénescence, l'homéostasie du fer et la production de cytokines (Fig. 2b), notamment CDKN1A, CEBPB, ZFP36 et FTL33. Ce profil est évocateur d'une microglie sénescente34. Le groupe 10 est défini par l'expression de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et la réparation de l'ADN35,36 (Fig. 2b). Les voies enrichies dans le cluster 10 confirment l'augmentation relative des gènes impliqués dans les processus du cycle cellulaire et une diminution des gènes de traitement des endosomes et des cytokines (Fig. 2c). Comme prévu pour la microglie de différents phénotypes activés et non activés, l'expression de gènes tels que P2RY12 variait, tandis que les gènes de la microglie, tels que C3 et CD74, avaient une représentation plus similaire dans les sous-groupes de microglie (Fig. 2d).

Ensuite, nous avons trouvé trois clusters, les clusters 3, 5 et 6, non décrits auparavant dans le cerveau humain. Ces grappes se distinguaient par leur expression génique du réseau endolysosomal (ELN) et leur enrichissement pour les signatures de la voie ELN par rapport à la microglie HM. Nous les annotons donc collectivement comme ELN. Le groupe 3 est défini par les gènes impliqués dans l'internalisation des protéines agrégées (Fig. 2b)19,20,24,25,26,37 la phagocytose et le transport médié par les vésicules32. Les voies enrichies dans le groupe 3 comprennent les voies des endosomes et des lysosomes ainsi que le catabolisme et la liaison aux lipides, mais pas de processus inflammatoires (Fig. 2c). Les gènes impliqués dans la glycolyse ont une expression plus faible dans le cluster 3, le différenciant des deux autres clusters ELN, suggérant que ces cellules n'ont pas subi le passage métabolique à la glycolyse observé dans le phénotype inflammatoire de la microglie38. Les clusters 5 et 6 présentaient une signature ELN, bien qu'ils semblaient également métaboliquement actifs avec des caractéristiques inflammatoires distinctes. Le groupe 5 présentait une expression accrue de HSP90AA1, HIF1A et BAG3 en plus d'autres gènes de protéines de choc thermique (Fig. 2b), ce qui suggère que ces cellules réagissent au stress externe. Les gènes responsables de la glycolyse étaient également plus élevés dans le groupe 5 par rapport à HM, reflétant peut-être un passage à la glycolyse dans ces cellules38. Les voies enrichies dans ce cluster indiquent qu'il est actif dans l'endocytose, l'autophagie et la mitophagie (Fig. 2c). Le groupe 6 est caractérisé par des gènes d'activité métabolique et des voies de réponse au stress similaires au groupe 5 (Fig. 2c), mais avec un composant supplémentaire de signalisation d'interféron suggéré par des niveaux significativement plus élevés d'IRF3, IRF5 et IRF7. Le groupe 6 a également montré une expression accrue de la reconnaissance ADN/ARN cytosolique et des gènes antiviraux, y compris IFIT2, IFIT3 et TRIM22 (réf. 39), ainsi que le récepteur de reconnaissance de formes CARD9 et les médiateurs de l'inflammasome NLRP331,32,40,41,42 ,43. Il convient de noter, unique au groupe 6, que nous avons constaté que les gènes de réparation de l'ADN ATM et RNASEH2B avaient une expression plus faible. Alors que l'IL1β était augmenté dans le groupe 6 par rapport à HM, des niveaux encore plus élevés d'IL1β et d'expression d'autres molécules effectrices inflammatoires, telles que NFkB1, ont été trouvés dans le groupe 8, le groupe « inflammatoire » le plus canonique. Les voies enrichies dans le groupe 6 soutiennent également les réponses inflammatoires en amont aux stimuli de modèle moléculaire associés au danger, tels que l'enrichissement de la signalisation des récepteurs de type NOD (NLR). De plus, nous avons utilisé une méthodologie alternative pour identifier les voies biologiques et les liens entre elles, fournissant une validation pour les fonctions ELN des clusters 3, 5 et 6 (Extended Data Fig. 4). Des tables supplémentaires contenant les gènes responsables de la présence de chaque nœud dans le réseau sont disponibles sur Synapse.

Malgré le rôle de l'APOE dans le risque et la progression de l'AD44, à ce jour, aucune étude n'a défini les états de la microglie chez les individus présentant un génotype APOE spécifique. Parce que la plupart (13/22) de nos échantillons étaient homozygotes pour l'allèle APOE ε3, nous avons généré un sous-ensemble de notre ensemble de données qui se composait entièrement d'individus APOE ε3/ε3 (sept témoins et six pathologies AD, neuf femmes et quatre hommes ; 75 018 microglies noyaux). Après re-normalisation et re-clustering, nous avons identifié neuf clusters de microglie (Extended Data Fig. 5a). Ces grappes ont été définies par des gènes similaires à ceux qui ont défini les grappes dans l'ensemble de données sur le génotype APOE mixte (données étendues Fig. 5b et données supplémentaires 2). Nous avons constaté que, dans la plupart des clusters, les DEG étaient très similaires (concordance d'environ 60 % ou plus) à ceux de l'ensemble de données APOE mixte (données étendues, Fig. 5c). Les clusters HM, neurodégénératif, inflammatoire, cycle cellulaire et endolysosomal étaient similaires à ceux de la cohorte Mixed APOE. Cela suggère que la présence de plusieurs grappes de microglies ELN distinctes est courante dans le cerveau humain, même lors du contrôle du génotype APOE.

Pour caractériser les réseaux de régulation des populations dans l'ensemble de données, nous avons identifié les principaux réseaux axés sur les facteurs de transcription (régulons) contrôlant l'expression des gènes dans chacun des groupes de microglie (Fig. 3). Chaque cluster est défini par un ensemble spécifique de régulons (Fig. 3a), soutenant l'hypothèse selon laquelle l'expression génique différentielle caractérisant chaque cluster est déterminée par des mécanismes de régulation transcriptionnelle. Pour démontrer la diversité des régulons prédits pour piloter l'expression des gènes dans différents clusters, nous mettons en évidence les clusters 3, 5, 6 et 8 (Fig. 3b). Chacun de ces clusters montre un ensemble différent de régulons qui apparaissent comme l'un des 10 premiers pour ce cluster à plusieurs reprises à travers les permutations de l'analyse. Par exemple, le cluster 5 partage un phénotype glycolytique et endolysosomal avec le cluster 6 mais ne partage pas les régulons du facteur de réponse à l'interféron prédits pour le cluster 6. nous avons observé des régulons supplémentaires (et différents) du facteur de réponse à l'interféron dans le groupe 6. Les régulons supérieurs des autres groupes diffèrent également les uns des autres (données étendues Fig. 6). MAFB, un facteur de transcription associé à la régulation des gènes anti-inflammatoires, était en tête de liste dans le groupe 3 (réf. 16). En revanche, les régulons dirigés par des facteurs de transcription généralement associés aux réponses antivirales, IRF7 et, dans une moindre mesure, IRF3, étaient en tête de liste dans le groupe 6, ce qui concorde avec l'observation que ces cellules sont également enrichies pour la reconnaissance des acides nucléiques et les voies endolysosomales ( figure 3b). Les régulons supérieurs pour le sous-ensemble d'individus APOE ε3 / ε3 démontrent une diversité unique similaire à ceux décrits dans l'ensemble de données plus large, suggérant à nouveau une homologie entre les génotypes APOE (Extended Data Fig. 7). Ensemble, ces réseaux de gènes inférés et leurs régulons de facteur de transcription démontrent la diversité des grappes identifiées ici et fournissent des cibles réglementaires potentielles pour de futures études à étudier.

a, le flux de travail SCENIC a identifié des réseaux régulés par des facteurs de transcription associés à différents groupes phénotypiques de microglie. Carte thermique de l'aire sous la courbe (AUC) du facteur de transcription (activité régulon en grappes). b, Pourcentage de cas où des régulons de facteur de transcription sont apparus dans les 10 meilleurs scores de spécificité de régulon par groupe (sur 27 permutations). Une couleur plus foncée indique un pourcentage de réplication plus élevé.

Des expériences dans des systèmes modèles avec des stimuli définis ont démontré le potentiel de la microglie à acquérir divers phénotypes. Cependant, comprendre la progression et les changements phénotypiques acquis par la microglie humaine in vivo est difficile. Nous avons utilisé notre ensemble de données à noyau unique pour étudier les transitions transcriptomiques de la microglie à l'aide de la méthode d'inférence de trajectoire Monocle3 (réf. 45) (Fig. 4). Nous avons demandé quel groupe pouvait être l'état final par rapport à l'état de transition en tant qu'exercice générateur d'hypothèses. Les trajectoires de ramification qui en résultent suggèrent que plusieurs états de transition rayonnent de HM, le cluster enrichi pour l'expression des gènes homéostatiques, soutenant l'hypothèse selon laquelle la microglie «homéostatique» peut passer à plusieurs phénotypes de point final chez l'homme, comme le prédisent les études modèles10,16,17. Nous avons trouvé des relations entre les clusters qui n'étaient pas immédiatement apparentes lors de l'exploration des DEG et de la GSEA seules. L'analyse de la trajectoire a révélé un point de ramification où la progression cellulaire continue vers le cluster ELN de stress autophagique (cluster 5) ou vers l'ELN inflammatoire, cluster 6 (Fig. 4). Le groupe 5 est adjacent au groupe de type sénescent (groupe 9), conformément à la notion selon laquelle l'autophagie et la sénescence sont des voies et des paramètres biologiques liés. Semblable au travail de Nguyen et al.26, le cluster mobile (cluster 7) est un autre point final.

L'inférence de trajectoire monocle appliquée à l'ensemble de données sur la microglie démontre que plusieurs options phénotypiques rayonnent vers l'extérieur à partir du groupe 1. Chaque branche a plusieurs points finaux potentiels, ce qui suggère que la microglie peut ne pas progresser le long d'une trajectoire linéaire à une seule étape, mais plutôt passer par l'un des plusieurs états de transition vers atteindre divers phénotypes terminaux transcriptomiques.

Les groupes inflammatoires exprimant des marqueurs homéostatiques et canoniques (HM et groupe 8, respectivement) étaient également représentés par la MA et le cerveau témoin. En revanche, nous avons constaté que le groupe 6 avait plus de noyaux AD que prévu dans notre ensemble de données (P ajusté = 0, 006), ce qui suggère que les processus pertinents pour AD peuvent être représentés dans le profil de ce groupe (Fig. 5a). Plusieurs études d'association à l'échelle du génome de la MA ont identifié des allèles à risque associés aux gènes exprimés dans la microglie ou les cellules myéloïdes4. À l'aide d'une liste de 46 gènes dans des loci de polymorphisme mononucléotidique associés à un risque altéré de MA44,46, nous avons utilisé la GSEA pour évaluer l'enrichissement de ces gènes dans les 10 grappes de microglie identifiées. Nous avons observé que davantage de gènes de risque de MA sont exprimés de manière différentielle dans le groupe 6 (Fig. 5b) par rapport à tous les autres groupes (P ajusté <0,001). L'expression des gènes de PICALM, SORL1 et PLCG2 était significativement plus faible dans le cluster 6 par rapport au reste des clusters, tandis que d'autres gènes, notamment APP, APOE et BIN1, avaient une expression significativement plus élevée (tous ajustés P <0, 001; Fig. 5b). En utilisant un ensemble alternatif de gènes ELN, nous démontrons une expression différentielle significative dans le groupe 6, alors que les gènes associés au TLR étaient plus souvent fortement exprimés dans le groupe 8 (données étendues Fig. 8a, b). Les gènes associés à la «microglie associée à la maladie» ont été enrichis dans plusieurs clusters, contrairement à un seul cluster observé dans les modèles de souris AD19 (Extended Data Fig. 8c). Nous avons en outre étudié si un phénotype de microglie présent dans le vieillissement sain était réduit dans le cerveau AD. Nous avons déterminé que le groupe 10, le groupe exprimant de manière différentielle les gènes régulateurs du cycle cellulaire, est plus grand dans le cerveau témoin que dans le cerveau AD (APOE mixte ajusté P <0, 001 et APOE ε3 / ε3 ajusté P <0, 001; Fig. 5a). Le cluster 10 est le plus petit cluster de notre ensemble de données et mérite donc une réplication ; cependant, ces données suggèrent que la pathologie de la MA peut impliquer une réduction détectable dans un cluster de microglie enrichi pour le cycle cellulaire et les gènes de réparation de l'ADN.

a, le groupe 6 est significativement augmenté dans le cerveau AD (p corrigé du chi carré FDR = 0, 0064), tandis que le groupe 10 est augmenté dans les échantillons de contrôle (Ctrl) (p corrigé du chi carré FDR = 0, 0006). b, La carte thermique de l'expression des gènes de risque associés à la MA dans les groupes de microglie montre une expression différentielle plus forte dans le groupe 6. c, Démonstration de l'hétérogénéité de la morphologie des lysosomes dans la microglie. Des images représentatives d'un cas de MA démontrent une microglie (Iba-1, verte) avec une hétérogénéité dans la morphologie et le signal de la lampe-1. Les exemples sont d'un signal de lysosome ramifié (flèche du haut) et supérieur (Lampe-1, magenta) et d'un phénotype « activé » ou moins ramifié (flèche du bas). d, Microglie représentative (Iba-1, verte) avec une expression élevée de PTGDS (rouge), un marqueur du groupe 6 dans un cas de MA. e, microglie représentative (Iba-1, vert) avec une expression élevée de P2RX7 (magenta), un marqueur du groupe 6 dans un cas de MA. f, Un exemple représentatif de microglie activée avec à la fois un grand nombre de lysosomes (Lampe-1, blanc) et d'ADNdb cytosolique (magenta) dans un cas de MA. Toutes les images représentatives en c–f affichent une coloration répliquée dans plusieurs champs et au moins trois cerveaux humains. Toutes les barres d'échelle représentent 15 µm. **P corrigé < 0,01.

Les données transcriptomiques prédisent l'hétérogénéité des phénotypes endolysosomiques de la microglie dans les cerveaux témoins âgés et AD. L'immunomarquage pour LAMP1, un marqueur lysosomal, a révélé un spectre de phénotypes lysosomal avec une taille et un nombre lysosomal variables (Fig. 5c). Des marqueurs du groupe 6 exprimant la microglie ont été identifiés dans le cerveau AD par immunomarquage pour les produits protéiques de PTGDS (Fig. 5d) et P2RX7 (Fig. 5e), deux gènes hautement exprimés dans ce sous-groupe. Les microglies des groupes 6 et 8 présentent toutes deux une expression différentielle de gènes impliqués dans la détection des molécules d'ADN/ARN, ce qui suggère que la microglie peut être activée par exposition à des acides nucléiques cytosoliques. Pour évaluer la présence d'acides nucléiques cytosoliques dans la microglie, nous avons immunomarqué la microglie pour l'ADN double brin (ADNdb) (Fig. 5d). Nous avons observé que la microglie présentant une immunoréactivité pour l'ADNdb contenait également des lysosomes agrandis, alors que d'autres microglies dans la même section de tissu avaient une taille de lysosome normale et aucune immunoréactivité pour l'ADNdb (Extended Data Fig. 9). Ces résultats suggèrent que l'hétérogénéité de la microglie reflétée par les modèles d'expression génique peut représenter des phénotypes morphologiques qui peuvent être détectés dans les tissus humains.

Nous avons estimé que, compte tenu des changements d'inflammation connus associés aux profils moléculaires du cerveau humain, il pourrait être difficile de détecter des signatures spécifiques à la MA lors de l'étude de sous-populations polarisées dans la MA et les tissus cérébraux âgés. Nous avons porté notre attention sur la complexité au sein de HM. Comme indiqué précédemment, nous avons observé que HM est la plus grande population et proportionnellement similaire dans les échantillons de cerveau de contrôle AD et âgés22,25,26. Cette population n'a pas été largement caractérisée pour comprendre l'impact de la MA sur l'expression des gènes dans la microglie homéostatique. Notre ensemble de données a étudié plus de 50 000 microglies enrichies en marqueurs homéostatiques, permettant la détection de sous-groupes au sein de la population de microglies HM. La microglie HM sous-clustering a révélé sept populations avec une expression génique différentielle (Fig. 6a). Nous avons constaté que, contrairement au plus grand ensemble de données sur la microglie, il existait un sous-groupe presque unique pour les cas de MA. Ce sous-groupe de microglie spécifique à la MA, le sous-groupe 1.5 (Fig. 6b), était presque exclusivement composé de microglie de la MA, ce qui suggère qu'il pourrait être uniquement entraîné par la pathologie de la MA (P ajusté <0,001). En revanche, le sous-groupe 1.4 était surreprésenté par les noyaux de contrôle (Fig. 6b ; P ajusté <0,05). Les sous-clusters HM ont montré une expression élevée de P2RY12, avec l'expression la plus élevée dans le sous-cluster 1.5 (Fig. 6c). D'autres marqueurs d'expression génique du sous-cluster HM 1.5 étaient plus spécifiques, notamment les DEG WIPF3, PDE4B et KCNIP (Fig. 6c). Pour commencer à caractériser les processus biologiques putatifs représentés dans ces sous-groupes, nous avons effectué la GSEA comme ci-dessus. Le sous-groupe 1.5 avait un profil unique d'enrichissement pour les gènes impliqués dans la motilité cellulaire et la signalisation calcique (Fig. 6d). En utilisant l'immunohistochimie, nous avons validé la présence d'une expression double positive des protéines P2RY12 et PDE4B dans la microglie du cerveau humain atteint de MA (Fig. 6e). Nous avons également vérifié ces résultats dans notre cohorte de tous les individus APOE ε3/ε3. Nous avons confirmé que, encore une fois, le groupe de microglies enrichi pour l'expression génique homéostatique pouvait être divisé en plusieurs populations avec une expression génique distincte et qu'un tel groupe était enrichi dans les cas de MA (Extended Data Fig. 10).

a, le sous-groupement de la microglie marqueur homéostatique du groupe 1 (HM) a révélé sept sous-populations définies par l'expression différentielle des gènes. b, le sous-groupe 1.5 est considérablement étendu dans les échantillons de cerveau AD (P corrigé du chi carré FDR = 6,2936 × 10−13), tandis que le sous-groupe 1.4 est augmenté dans les échantillons de cerveau de contrôle (Ctrl) (p corrigé du chi carré FDR = 0,0194) . c, L'expression génique de P2RY12 démontre une expression élevée dans les sous-clusters HM, avec une expression la plus élevée dans le sous-cluster 1.5. Les gènes différentiellement exprimés dans le sous-groupe 1.5, tels que WIPF3, PDE4B et KCNIP, démontrent également une expression élevée. d, l'enrichissement des voies dans le sous-groupe 1.5 démontre un enrichissement unique pour la motilité, l'activité des canaux ioniques et les processus liés aux neurones. e, L'immunohistochimie valide la présence de microglies doublement positives exprimant P2RY12 et PDE4B dans le cerveau AD. Les images représentatives affichent une coloration répliquée dans plusieurs champs et au moins trois cerveaux humains. Barres d'échelle, 25 µm. *P corrigé < 0,05 ; **P corrigé < 0,01. Reg., règlement.

Cette étude a identifié 10 grappes de microglie distinctes du cerveau humain âgé. Ceux-ci comprenaient des phénotypes transcriptionnels homéostatiques, sénescents et inflammatoires de la microglie décrits précédemment ainsi que des groupes supplémentaires de spécifications transcriptionnelles, qui peuvent donner un aperçu de la pathogenèse de la MA, fournissant une plate-forme pour la génération d'hypothèses. Nous décrivons la diversité des clusters de microglie avec des signatures de gènes endolysosomales, dont l'une est enrichie de gènes de reconnaissance d'acide nucléique et de régulation de l'interféron. Les réseaux de gènes inférés prédisent que les clusters individuels sont entraînés par des facteurs de transcription distincts, ce qui renforce la diversité fonctionnelle des clusters. À l'aide d'une analyse d'inférence de trajectoire, nous avons observé des transitions dans les phénotypes de la microglie et prédit des relations qui peuvent être testées expérimentalement. Les cas de MA se distinguaient par l'émergence d'un sous-cluster exprimant des gènes homéostatiques (sous-cluster 1.5) caractérisé par une altération de la transcription des gènes impliqués dans l'activation du calcium, la réponse aux blessures et les voies de motilité.

La fonction endolysosomale est essentielle pour le trafic et la dégradation des protéines pathologiques, et le dysfonctionnement de l'ELN est impliqué dans la pathogenèse de la MA. On en sait moins sur les implications du dysfonctionnement de l'ELN spécifiquement dans la microglie AD47. Cette étude a identifié trois clusters de microglie, les clusters 3, 5 et 6, distingués par l'expression des composants ELN, chacun avec un schéma distinct d'endocytose, de trafic de vésicules, d'expression génique des voies endolysosomales et autophagosomes. Il est proposé que la fonction endolysosomale microgliale altérée contribue à la pathogenèse de la MA par une clairance amyloïde insuffisante1,47. Cependant, l'ELN dans les cellules myéloïdes joue également un rôle essentiel dans l'identification et le traitement des microbes étrangers, y compris l'initiation du TLR et la signalisation de l'interféron31,48. L'expression génique dans le groupe 6 (le sous-type surreprésenté dans les cas de MA) était caractérisée par un enrichissement pour l'expression de gènes impliqués dans la fonction lysosomale et vésiculaire et une expression accrue concomitante du facteur régulateur de l'interféron et des gènes d'activation de l'inflammasome40,42,49,50. Bien qu'il n'y ait pas un seul phénotype « DAM » dans la MA humaine, nous avons observé un groupe de réponse à l'interféron de type 1 distinct d'un phénotype inflammatoire dystrophique ou canonique18,19,37,51. Nous émettons l'hypothèse que l'expression de l'IRF ici peut refléter l'exposition à des molécules de modèle moléculaire associées à un danger, y compris les acides nucléiques de la microglie ou des cellules voisines. Cette hypothèse est étayée par notre observation de la microglie présentant une immunoréactivité à l'ADNdb cytosolique et à la morphologie amiboïde (Fig. 5). Ces résultats concordent avec les études murines et in vitro démontrant que les fibrilles amyloïdes contiennent des acides nucléiques et induisent une réponse d'interféron de type I dans la microglie, entraînant une perte de synapse50. Song et al.49,52 ont rapporté un rôle clé pour l'ELN dans la dégradation des acides nucléiques et la réponse de l'interféron aux dommages à l'ADN après la libération d'ADN nucléaire dans le cytosol, conformément au phénotype que nous décrivons ici. La microglie du groupe 6 a non seulement augmenté en tant que population dans les cas de MA, mais a également démontré une expression différentielle significative d'un certain nombre de gènes associés au risque génétique de MA (Fig. 5). Cette observation soutient l'hypothèse selon laquelle le dysfonctionnement des cellules inflammatoires est un contributeur important au risque de MA et suggère que le sous-type de microglie représenté par le groupe 6 peut être un sous-type de microglie à cibler pour une intervention thérapeutique.

Nous avons exploité notre ensemble de données pour appliquer des méthodes de trajectoire afin de déduire les relations potentielles entre les phénotypes transcriptionnels microgliaux. Les clusters dystrophiques (cluster 4) et sénescents (cluster 9) émergent comme des «états finaux», démontrant comment l'inférence de trajectoire computationnelle peut cartographier les phénotypes microgliaux conformément aux prédictions des données empiriques précédentes10,16,17. Néanmoins, comme pour toutes les analyses bioinformatiques, ces résultats doivent être considérés comme générateurs d'hypothèses. L'analyse de la trajectoire a également montré que les clusters de stress autophagique et d'ELN inflammatoire (cluster 5 et cluster 6, respectivement) représentaient un point de branchement du cluster 1. Alternativement, le cluster 3 semblait être une phase de transition entre le cluster homéostatique et les clusters mobiles ou dystrophiques. . Ces résultats sont similaires à ceux d'un précédent rapport de Nguyen et al.26. Notre analyse nomme les régulateurs génétiques de chaque groupe, et ensemble ces données peuvent être utilisées pour guider d'autres études pour tester la plasticité ou la réversibilité du phénotype de la microglie53. De plus, contrairement à d'autres types de cellules qui sont différenciées en phase terminale, il est plausible que la microglie puisse entrer et sortir des états transcriptomiques, soulignant la nature «instantanée» des omiques tissulaires.

Nous avons détecté un phénotype de microglie spécifique à la MA, sous-groupe 1.5, dans le groupe exprimant un marqueur homéostatique, groupe 1. Le surnom « homéostatique » est souvent invoqué pour décrire un groupe exprimant des gènes appelés homéostatiques en raison de leur expression réduite lors de l'activation microgliale. On ne sait pas si ces gènes ont vraiment un rôle actif dans la direction d'une cellule activée ou blessée pour qu'elle reprenne un état moins réactif ou dans le maintien d'un état particulier. Néanmoins, nous avons constaté que le groupe identifié comme « homéostatique » à l'aide des marqueurs homéostatiques typiques dément une complexité des profils de microglie qui peuvent détenir des indices sur des changements microgliaux précoces ou subtils en réponse à la pathologie de la MA. À titre d'exemple, le sous-groupe 1.5 montre l'expression la plus élevée de P2RY12 ainsi que l'expression de gènes qui suggèrent une autre couche d'activité. Il convient de noter que P2RY12 est associé à des phénotypes microgliaux actifs et est considéré comme essentiel pour les étapes initiales de la motilité au cours de l'inflammation54. Le gène le plus régulé différentiellement dans le sous-groupe 1.5 est PDE4b, une phosphodiestérase impliquée dans la fonction cognitive55 et l'activation inflammatoire des cellules myéloïdes56,57. PDE4b régule les niveaux d'AMPc, dont il a été démontré qu'ils modulent le comportement de surveillance de la microglie58. Le sous-groupe 1.5 démontre également un enrichissement des voies de signalisation de la motilité et du calcium, ce qui pourrait suggérer une réponse à l'activité neuronale ou une extension des processus microgliaux53. Par conséquent, nous supposons que le sous-groupe 1.5 peut représenter des changements de phénotype microglial précoces ou subtils en réponse à une protéine pathologique, mais pas un phénotype entièrement activé immunologiquement.

Comme pour toutes les études snRNA-seq, il y a des limites à notre étude. Bien que le tri PU.1 fournisse un moyen d'augmenter les noyaux de la microglie pour une plus grande résolution des phénotypes au niveau d'un sujet individuel, il sélectionne potentiellement une population spécifique de microglie. De plus, bien que les marqueurs myéloïdes microgliaux et périphériques connus utilisés pour annoter les cellules augmentent la confiance d'une désignation microgliale, il est toujours possible que les noyaux inclus puissent être un type de cellule myéloïde cérébrale différent. Les DEG qui ont été identifiés à l'aide de clusters définis par les mêmes données ne sont pas nécessairement correctement contrôlés59 ; cependant, notre ensemble de données permettra à d'autres d'utiliser nos clusters pour atténuer cela à l'avenir. Bien que le nombre total de microglies de chaque sujet soit important, le nombre total de sujets étudiés est de 22. Des études supplémentaires dans des cohortes plus importantes sont nécessaires pour valider ces résultats ou peut-être donner un aperçu supplémentaire de la diversité microgliale. L'expression génique est un outil moléculaire utile pour le sous-typage cellulaire, mais elle ne décrit pas toujours directement l'expression, la localisation ou la fonction des protéines60. Les études futures portant sur un panel de protéines basées sur les signatures transcriptomiques rapportées ici seront utiles à la fois pour la validation ainsi que pour la corrélation spatiale avec les caractéristiques pathologiques. L'évaluation des phénotypes microgliaux dans les régions du cerveau peut fournir un contexte supplémentaire à la compréhension de l'hétérogénéité phénotypique. Une autre limitation importante est l'utilisation de tissu cérébral d'autopsie. Il est possible que des événements juste avant la mort ou des changements post-mortem contribuent aux changements d'expression mesurés ici. Pour atténuer la variabilité de la qualité des tissus, nous avons sélectionné uniquement les tissus avec un pH supérieur à 6,0 et un intervalle post-mortem (PMI) inférieur à 10 h.

Dans cette étude, nous avons identifié des états de microglie à partir de noyaux cérébraux post-mortem humains isolés. Parmi les noyaux répondant aux critères d'une signature transcriptomique de la microglie, une « signature de vieillissement » a été observée dans tous les groupes de cette étude23, ce qui correspond à notre cohorte plus âgée. L'inflammaging61 peut non seulement confondre les interprétations des profils d'expression génique attribuables à la MA, mais peut également contribuer aux mécanismes de la maladie supposés conduire à la MA. Des études supplémentaires explorant les différences entre les témoins plus jeunes et la maladie d'Alzheimer précoce peuvent également aider à explorer les signatures spécifiques au vieillissement, à l'inflammation et à la maladie d'Alzheimer. Notre identification de multiples grappes d'internalisation et de trafic avec différents modèles d'expression de gènes métaboliques et inflammatoires fournit une plate-forme pour d'autres études. La découverte d'un sous-cluster spécifique à la MA au sein de la population de microglies enrichies pour l'expression des gènes homéostatiques suggère également que la MA change et, par conséquent, les voies moléculaires conduisant la MA peuvent être identifiées dans des cellules qui n'ont pas encore été complètement explorées. Les altérations spécifiques au cluster dans la composition, l'expression des gènes et la régulation des gènes dans le cerveau de la MA fournissent des informations supplémentaires pour soutenir le ciblage personnalisé des réponses physiologiques microgliales qui seront essentielles pour aller de l'avant dans la thérapeutique des maladies neurodégénératives.

Notre recherche est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes et a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'Université de Washington. Le tissu du cortex préfrontal dorsolatéral (dlPFC) de cerveaux humains a été obtenu auprès du centre de neuropathologie du centre de recherche sur la maladie d'Alzheimer de l'Université de Washington après consentement éclairé écrit. Les patients (n = 12) ont été confirmés post-mortem comme ayant une pathologie de la maladie d'Alzheimer (score de changement neuropathique de la maladie d'Alzheimer (ADNC) de 2 à 3 ; tableau 1). Les individus témoins (n ​​= 10) avaient peu ou pas de neuropathologie post-mortem (score ADNC 0–1 ; tableau 1).

Les échantillons de cerveau ont été congelés et stockés à -80°C. Les critères d'inclusion comprenaient un PMI ≤ 10 h, une faible pathologie comorbide (corps de Lewy et sclérose hippocampique) et un pH cérébral à l'autopsie ≥ 6.

Les noyaux d'échantillons de cerveau ont été isolés à l'aide de protocoles adaptés de 10x Genomics Demonstrated Protocols et De Groot et al.62. En bref, quatre poinçons de 2 mm de matière grise dlPFC ont été prélevés à l'aide d'un poinçon de biopsie (Thermo Fisher Scientific) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml sur de la neige carbonique. Toutes les recettes de tampons, de solutions et de médias se trouvent dans les tableaux supplémentaires 1 à 7. L'isolement des noyaux a utilisé un tampon de lyse des noyaux. Les noyaux dans la solution de suspension de noyaux ont été étalés sur 900 µl de tampon de gradient percoll/myéline62. Le gradient a été centrifugé à 950g pendant 20 min à 4°C avec une accélération lente et sans frein. La myéline et le surnageant ont été aspirés, et le culot de noyaux a été remis en suspension dans un tampon de resuspension à une concentration de 1 000 noyaux par microlitre et a immédiatement procédé au snRNA-seq.

En bref, 100 à 250 mg de matière grise dlPFC ont été recueillis dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml sur de la neige carbonique. Le tissu cérébral a été homogénéisé comme ci-dessus. L'homogénat a été incubé à 4 ° C sous agitation douce pendant 10 min, culotté à 500 g pendant 7 min à 4 ° C et remis en suspension dans 900 µl de tampon de gradient percoll / myéline additionné d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase. La suspension a été délicatement recouverte de 300 ul de solution de suspension de noyaux additionnée d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Le gradient a été centrifugé à 950g pendant 20 min à 4°C avec une accélération lente et sans frein. La myéline et le surnageant ont été aspirés et le culot de noyaux a été immédiatement transféré au FANS.

Les noyaux ont été lavés avec du milieu FANS froid (10% FBS, 10 mM HEPES, 100 μM ATA, 10% 10 × HBSS, 0,5% Protector RNase Inhibitor, inhibiteurs de protéase et de phosphatase et 1% saponine dans de l'eau sans nucléase) et remis en suspension dans FANS milieu à une concentration de 2–2,5 × 106 noyaux par millilitre. Les noyaux ont été incubés avec 1 % de bloc Fc humain (clone Fc1.3216, BD Biosciences) sur de la glace pendant 10 min. Les noyaux ont été marqués soit avec un anti-PU.1-PE (clone 9G7, 1:50, Cell Signaling Technology) soit avec un contrôle d'isotype IgG-PE (clone DA1E, 1:50, Cell Signaling Technology) pendant 4 h sur de la glace, suivi de trois lavages avec du milieu FANS froid et remis en suspension dans du milieu FANS additionné de 10 μg ml-1 DAPI (Sigma-Aldrich). Les noyaux ont été triés à l'aide d'un FACSAria III (BD Biosciences) jusqu'à ce que 30 000 noyaux positifs pour PU.1 aient été collectés. Les noyaux triés ont été centrifugés à 1 000 g pendant 10 min à 4 °C. Le culot de noyaux a été remis en suspension dans un tampon de resuspension à une concentration de 1 000 noyaux par microlitre et a procédé immédiatement au snRNA-seq.

Des bibliothèques à noyau unique ont été générées à l'aide du kit Chromium Next GEM Single Cell 3 'GEM, Library and Gel Bead Kit version 3 (10x Genomics) selon le protocole du fabricant et une capture cible de 10 000 noyaux. Les bibliothèques d'expression génique ont été séquencées sur la plateforme NovaSeq 6000 (Illumina).

Le nombre de gènes a été obtenu en alignant les lectures sur le génome hg38 (GRCh38-1.2.0) à l'aide du logiciel CellRanger 3.0.2 (10x Genomics). Les lectures cartographiées sur l'ARNm précurseur ont été incluses pour tenir compte des transcrits nucléaires non épissés. La plupart de nos analyses ont été réalisées en R (R Development Core Team 2010). Les gouttelettes de 22 échantillons triés PU.1 ont été combinées à l'aide de Seurat version 3.3 (réf. 63). Les gouttelettes non triées et triées PU.1 isolées des quatre mêmes sujets ont été combinées à l'aide de Seurat et analysées de la même manière. Les gouttelettes contenant moins de 350 identifiants moléculaires uniques, moins de 350 gènes ou plus de 1 % de gènes mitochondriaux ont été exclues de l'analyse. L'ARN ambiant a été retiré des gouttelettes restantes à l'aide de SoupX64. Les gouttelettes contenant plusieurs noyaux ont été notées à l'aide de Scrublet65 et retirées. Au total, 200 948 noyaux avec une moyenne de 1 787 gènes par noyau sont restés dans l'ensemble de données pour une analyse plus approfondie.

La normalisation et le regroupement des noyaux ont été effectués à l'aide de la version 3.3 de Seurat (réf. 63). Les données ont été normalisées pour la profondeur de lecture et le contenu des gènes mitochondriaux a été régressé à l'aide de SCTransform66 de Seurat. La variabilité des échantillons individuels a été supprimée à l'aide des fonctions d'ancrage et d'intégration de Seurat63. Les 5 000 principaux gènes variables ont été conservés. Quinze composantes principales (PC) ont été utilisées pour créer un graphe partagé des plus proches voisins avec k = 20. La fonction de modularité a été optimisée à l'aide d'une résolution de 0,2 pour déterminer les clusters à l'aide de l'algorithme de Louvain avec un raffinement à plusieurs niveaux pour déterminer les types de cellules larges. Chaque groupe a atteint un seuil minimum de 30 DEG définissants et comprenait des noyaux de plus de 10 % de la cohorte (plus de deux individus).

Les grappes ont été annotées pour le type de cellule à l'aide d'une évaluation manuelle pour un ensemble de marqueurs génétiques connus67. Un nouvel objet Seurat a été fabriqué contenant uniquement les noyaux de la microglie (n = 127 371). La normalisation, la suppression de la variabilité individuelle, l'intégration et la création de graphes des plus proches voisins partagés ont été répétées comme ci-dessus sur les noyaux de la microglie. Vingt PC ont été choisis pour tenir compte d'une part importante de la variance. Les grappes ont été déterminées à l'aide de l'algorithme de Leiden68 avec method=igraph et weights=true. Les clusters ont été hautement conservés à travers l'analyse par Louvain, Louvain avec raffinement à plusieurs niveaux et les algorithmes de Leiden. Le sous-groupement de clusters homéostatiques pour l'ensemble de données de 22 échantillons et l'ensemble de données d'allèles APOE ε3 / ε3 s'est produit après la normalisation, la suppression de la variabilité individuelle et l'intégration comme auparavant et a été effectué à l'aide de 10 PC et de l'algorithme de Louvain avec raffinement à plusieurs niveaux. La distribution des noyaux au sein de chaque cluster a été calculée à l'aide de la fonction "chisq.test" dans R pour comparer le pourcentage réel de noyaux du groupe AD ou du groupe témoin au sein du cluster à la proportion attendue de noyaux qui seraient contribués en fonction de la composition de l'ensemble de données. Les valeurs P des tests du chi carré ont été ajustées à l'aide du taux de fausses découvertes (FDR) et considérées comme significatives si P ajusté < 0,05.

L'analyse différentielle de l'expression génique des grappes a été réalisée avec l'algorithme MAST. Les gènes testés avaient une expression dans au moins 25 % des noyaux du cluster. Les DEG avaient un P ajusté au FDR < 0,05 et un changement de facteur logarithmique > 1,25. Le groupe 1 a été annoté comme inactivé, souvent appelé «homéostatique» dans les études à noyau unique de la microglie. L'analyse différentielle de l'expression génique a été répétée comme ci-dessus en comparant les autres clusters au cluster 1. La GSEA a été réalisée dans ClusterProfiler69 modifié pour utiliser une graine définie pour la reproductibilité, en utilisant les ensembles de voies GO, KEGG et Reactome, version 7.2. Les voies enrichies avaient un P ajusté au FDR < 0,05. Nous avons considéré que les voies étaient représentatives si des résultats significatifs incluaient des gènes et des fonctions biologiques similaires dans au moins deux des trois principales bases de données (GO, KEGG et Reactome).

Une approche complémentaire à la GSEA consiste à effectuer un regroupement d'ontologies de processus biologiques pour identifier un ensemble plus étendu de termes associés à la liste de gènes. Pour caractériser davantage les clusters ELN (3, 5 et 6), nous avons mis en œuvre cette approche pour obtenir un examen plus raffiné du processus biologiquement lié entraîné par chaque cluster. Nous avons utilisé plusieurs approches différentes pour effectuer cette analyse, en choisissant finalement l'application de regroupement de réseaux Cytoscape ClueGO70,71, qui a été largement utilisée ces dernières années à cette fin72,73,74,75. Cela crée un réseau de processus génétiquement liés qui va au-delà d'un seul terme GO, offrant une plus grande confiance qu'un processus biologique de base est impacté en fonction de l'expression différentielle d'un ensemble particulier de gènes. Les groupes 3, 5 et 6 ont chacun été soumis indépendamment pour analyse à l'aide d'un algorithme d'enrichissement positif unilatéral qui utilise des tests hypergéométriques, avec un seuil kappa de 0,4 pour optimiser les connexions des processus biologiques. Chaque terme tiré dans le réseau a été initialement filtré pour un seuil de corrections de tests multiples de P < 0, 05 et pondéré hiérarchiquement pour les termes avec une valeur de correction de Benjamini – Hochberg de P < 0, 01. Au fur et à mesure que cette procédure est effectuée à des fins de validation et de visualisation, nous avons réduit les réseaux de termes moins bien classés pour faciliter la visualisation.

L'analyse de trajectoire a été effectuée à l'aide de Monocle3 (réf. 45) sur plusieurs permutations de notre ensemble de données sous-échantillonné. Les données ont été sous-échantillonnées à 1 000, 2 000, 3 000 ou 5 000 noyaux par cluster et transférées vers un objet de jeu de données cellulaire, et Monocle3 « learn_graph » a été exécuté. L'analyse en composantes principales et les plongements d'approximation et de projection de variété uniforme (UMAP) ont été extraits de l'objet de Seurat. Nous avons appliqué l'algorithme avec et sans point de départ défini. Les données sous-échantillonnées de 5 000 noyaux par cluster ont commencé à décomposer la capacité de Monocle à former une trajectoire cohérente, tandis que les 1 000, 2 000 et 3 000 permutations multiples formaient systématiquement quelque chose de similaire à l'image représentative de la Fig. 5 (3 000 noyaux par cluster) .

Les régulons ont été déduits à l'aide du flux de travail SCENIC en Python (pySCENIC)76,77. Nous avons sélectionné au hasard 2 000, 3 000 ou 5 000 noyaux dans chaque cluster (ou, s'ils en ont moins que ce nombre, tous les noyaux du cluster) pour réduire le temps de calcul et avoir une représentation proportionnelle de tous les clusters. Nous avons créé cinq sous-ensembles de chaque combinaison et répété l'analyse deux fois pour chaque sous-ensemble afin d'évaluer la cohérence des régulons dans l'analyse. Tout d'abord, nous avons utilisé des comptages normalisés avec des gènes très variables pour générer les modules de réseau de régulation co-exprimant à l'aide de l'algorithme d'apprentissage automatique GRNBoost2 avec la fonction 'grn' et les paramètres par défaut76. Deuxièmement, les modules ont été filtrés à l'aide de la fonction "-ctx", qui utilise l'analyse de motifs cis-régulateurs (RcisTarget) pour ne conserver que les modules enrichis pour les gènes cibles putatifs du facteur de transcription. Les régulons sont identifiés en combinant plusieurs modules pour un seul facteur de transcription. Troisièmement, la fonction AUCell a été utilisée pour calculer l'activité du régulon pour chaque noyau. Les scores de spécificité du régulon ont été calculés pour chaque régulon dans chaque groupe. Les scores de spécificité de classement ont identifié les 10 meilleurs régulons pour un groupe spécifique pour un sous-ensemble donné de l'ensemble de données et la cohérence des résultats entre les sous-ensembles.

Les tissus disséqués du dlPFC des 22 cas de la cohorte ont été fixés avec du paraformaldéhyde et de la paraffine. Les échantillons ont été sectionnés à 15 µm et déparaffinés avant l'immunocoloration. Les lames ont été bouillies dans un tampon citrate (Sigma-Aldrich, C9999) pendant 20 min, puis transférées dans un tampon de blocage (10 % de sérum d'âne, 0,1 % de Trition X-100 et 0,05 % de Tween 20 dans du TBS) pendant 1 h à température ambiante. Les lames ont été incubées dans des anticorps primaires (anti-LAMP1 1:100, Invitrogen, 14-1079-80 ; anti-Iba-1 1:250, Abcam, ab5076 ; anti-dsDNA 1:250, Millipore, MAB1293 ; anti-PTGDS/ PGD2 1:100, R&D Systems, MAB10099 ; anti-P2RX7 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-514962 ; anti-P2RY12 1:50, Alomone, APR-012 ; et anti-PDE4B 1:50, LSBio, LS- C173292-100) pendant une nuit à 4 °C. Les lames ont été rincées trois fois dans du TBS-T pendant 5 min avant l'anticorps secondaire (Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 488 donkey anti-goat, A11055; Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse, A31570; Alexa Fluor 555 donkey anti- lapin 555, A31572 ; Alexa Fluor 647 âne anti-souris, A31571 ; ou Alexa Fluor 647 âne anti-lapin, A32795) incubation pendant 1 h à température ambiante. Les lames ont ensuite été colorées avec du DAPI (1:1 000, Millipore, D8417) pendant 5 min, suivi de trois lavages TBS-T de 5 min. Du True Black (Thermo Fisher Scientific, NC1125051) dilué au 1:20 dans de l'éthanol à 70 % a été ajouté aux lames pendant 50 s, suivi de deux lavages supplémentaires de 5 min dans du TBS avant d'être monté avec du Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100-01 ). Les diapositives ont été imagées à l'aide d'un microscope confocal Olympus FluoView-1000 ou d'un microscope confocal à disque rotatif (Nikon A1R avec tête de disque rotatif Yokogawa W1) avec des objectifs à huile ×40 et ×100, et la projection maximale des images z-stack a été générée. Les images ont été nettoyées à l'aide de Fidji.

Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, mais nos tailles d'échantillon sont similaires à celles rapportées dans les publications précédentes22,25,26. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées en aveugle des conditions des expériences. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. Le principal ensemble de données snRNA-seq de l'enrichissement en PU.1 à partir de dlPFC provient de 22 humains (12 AD et 10 donneurs âgés en bonne santé), tous âgés de plus de 60 ans. Parce que les échantillons ont été obtenus à partir d'humains et que l'étude a été conçue pour détecter les différences entre les cas de MA et les cerveaux âgés en bonne santé, les échantillons n'ont pas été randomisés entre les conditions. Nous avons contrebalancé les lots de séquençage en fonction du sexe et de l'état de la maladie de sorte que toutes les conditions soient présentes dans chaque lot de séquençage. L'analyse statistique des données pseudobulk RNA-seq et des données snRNA-seq a utilisé DESeq2 et MAST, respectivement. DESeq2 est conçu pour modéliser les données de comptage d'ARN-seq par une distribution binomiale négative, et MAST est conçu pour modéliser l'inflation nulle observée dans les données de snRNA-seq. Pour l'analyse statistique de la proportion de grappes, des données de comptage ont été utilisées, qui ne reposent pas sur une distribution normale. Lorsque l'ensemble de données a été sous-échantillonné pour l'analyse de trajectoire et la détection de régulons, les noyaux ont été sous-échantillonnés de manière aléatoire pour générer plusieurs itérations de l'ensemble de données qui représentaient uniformément les grappes et maintenaient les échantillons dans leurs proportions d'origine. Pour l'analyse de trajectoire, trois permutations sous-échantillonnées à trois résolutions de sous-échantillonnage (1 000, 2 000 ou 3 000 noyaux par cluster) ont été analysées pour un total de neuf itérations, aboutissant à des résultats similaires à ceux affichés à la Fig. 4. Pour la détection du régulon pySCENIC, l'ensemble de données était sous-échantillonné avec cinq permutations à 1 000 noyaux par cluster et trois permutations à 2 000 et 3 000 noyaux par cluster. Chacune de ces permutations a été exécutée plusieurs fois dans le pipeline pySCENIC, ce qui a entraîné 27 instances de détection de régulon. Ces 27 cas ont été compilés dans les scores de cohérence affichés à la Fig. 3 et à la Fig. 6. d'au moins trois échantillons humains.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

L'intégralité de l'ensemble de données anonymes généré pour cette ressource dans ses formes brutes et traitées par objet Seurat est disponible via Synapse (https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51272688). Les données sont disponibles dans des conditions d'utilisation contrôlées définies par la réglementation sur la protection de la vie privée. Pour accéder aux données, un accord d'utilisation des données est nécessaire. Cet enregistrement est en place uniquement pour assurer l'anonymat des participants à l'étude. Toutes les autres données de l'étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Cette ressource a également utilisé le génome hg38 humain accessible au public (GRCh38-1.2.0).

Les scripts utilisés pour générer nos analyses sont disponibles sur https://github.com/keprater/jayadevlab_pu.1_project. Le conteneur nécessaire pour exécuter les scripts avec le même Seurat et d'autres versions de package que celles utilisées dans le code est disponible en téléchargement sur https://hub.docker.com/r/keprater/jayadevlab/tags ou dans le projet Synapse avec le base de données. Utilisez le conteneur Tag 6.3 pour répliquer nos analyses avec les mêmes versions de package.

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Le financement de ces études a été fourni par RF1AG063540 (SJ et GAG), P30AG066509 (SJ, KEP, JEY et CDK), R01AG073918 (SJ et JEY) et le Weill Neurohub (SJ et CDK). Un soutien supplémentaire a été fourni par la Fondation Ellison (SJ). KEP a été soutenu par l'Institut national sur le vieillissement 5T32-AG052354-02. Les matériaux d'autopsie utilisés dans cette étude ont été obtenus auprès du centre de neuropathologie de l'Université de Washington, qui est soutenu par le centre de recherche sur la maladie d'Alzheimer (P50AG005136-33) et l'étude Adult Changes in Thought (U01AG006781). Ce travail a été facilité par l'utilisation de l'infrastructure avancée de calcul, de stockage et de mise en réseau fournie par le système de supercalculateur Hyak de l'Université de Washington.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Katherine E. Prater, Kevin J. Green.

Département de neurologie, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Katherine E. Prater, Kevin J. Green, Sainath Mamde, Alexandra Cochoit, Carole L. Smith et Suman Jayadev

Programme de biostatistique, Division des sciences de la santé publique, Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson, Seattle, WA, États-Unis

Wei Soleil

Centre d'évolution et de médecine, Arizona State University, Tempe, AZ, États-Unis

Kenneth L. Chiou & Noah Snyder-Mackler

École des sciences de la vie, Centre d'évolution et de médecine, Université d'État de l'Arizona, Tempe, Arizona, États-Unis

Kenneth L. Chiou & Noah Snyder-Mackler

Sage Bionetworks, Seattle, WA, États-Unis

Laura Heath, Jesse Wiley et Benjamin Logsdon

Département de médecine de laboratoire et de pathologie, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Shannon E. Rose, C. Dirk Keene et Jessica E. Young

Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Ronald Y. Kwon, Jessica E. Young et Suman Jayadev

Département d'orthopédie et de médecine sportive, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Ronald Y.Kwon

Centre de recherche sur les maladies neurodégénératives ASU-Banner, Arizona State University, Tempe, AZ, États-Unis

Noah Snyder-Mackler

Division de génétique médicale, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Elizabeth E. Blue et Suman Jayadev

Institut Brotman Baty pour la médecine de précision, Seattle, WA, États-Unis

Elizabeth E. Blue

Cajal Neuroscience, Seattle, WA, États-Unis

Benjamin Logsdon

Département de biostatistique, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Ali Shojaie

Département de neurologie, Université de Caroline du Nord, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Gwenn A. Jardin

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Conception et conception des expériences : SJ, KJG, KEP, JEY, CLS, BL et GAG Réalisation des expériences : KJG, CLS, AC, SR et CDK Analyse des données : KEP, KJG, SM, AC, KLC et JW Supervision biostatistique : WS et AS Rédaction de l'article : KEP, KJG, SJ, SM et AC Édition de l'article : CLS, WS, AS, JY, EEB et GAG Code fourni : WS, SM, KLC, NS-M., RYK et LH Conceptualisation de la recherche et collaborations : SJ, GAG, JEY, EEB et BL

Correspondance à Suman Jayadev.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Aging remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

(A) La parcelle de tri des noyaux activés par fluorescence des noyaux isolés de la matière grise du cortex préfrontal dorsolatéral du tissu cérébral humain post-mortem démontre une population DAPI-positive à partir de laquelle les populations ultérieures sont tirées. (B) Isotype et exemples de coloration PU.1 démontrant la population positive PU.1. (C) Les données snRNAseq non triées de quatre échantillons montrent plusieurs types de cellules cérébrales et une petite population de microglie (n = 1032 cellules) qui peuvent être subdivisées en cinq groupes. (D) Après l'enrichissement PU.1, un ensemble de données snRNAseq des quatre mêmes individus contient un plus grand nombre de microglies (n = 23 310 cellules), et ces microglies peuvent être davantage discriminées en neuf grappes.

Les gènes marqueurs de la microglie, CX3CR1, C1Qb, SPI1 (PU.1) et APOE démontrent tous une expression plus élevée dans les 10 sous-groupes de microglie (numérotés de 1 à 10 à gauche) que dans les autres groupes de types de cellules (marqués par le type de cellule à droite) .

(A) Les gènes marqueurs d'astrocytes GFAP et S100B démontrent une expression plus élevée dans les deux sous-clusters Astrocytes-1 et Astrocytes-2 que dans les 10 sous-clusters de microglie définis. Alors que le groupe de microglies 6 a une expression de GFAP, il n'a pas d'expression de S100B. (B) Les marqueurs monocytes périphériques CCL5 et ont une faible expression dans notre ensemble de données mais sont plus fortement exprimés par le cluster CD163 + qui n'était pas inclus dans notre ensemble de données sur la microglie.

Les gènes exprimés de manière différentielle dans les groupes 3, 5 et 6 ont été utilisés pour piloter un enrichissement d'ontologie de gènes basé sur un réseau à l'aide de l'application Cytoscape ClueGO. Cette approche utilise un algorithme d'enrichissement positif unilatéral qui utilise des tests hypergéométriques, avec un seuil kappa de 0,4 pour optimiser les connexions de processus biologiques. Chaque terme tiré dans le réseau a été initialement filtré pour un seuil de corrections de tests multiples de p < 0,05, et pondéré hiérarchiquement pour les termes avec une valeur de correction de Benjamini-Hochberg de p < 0,01. Les nœuds sont représentés au sein de chaque réseau en fonction de deux facteurs : le nombre de gènes (taille du cercle) et la signification statistique (rouge vif = Benjamini-Hochberg corrigé p < 0,05 ; marron foncé = Benjamini-Hochberg corrigé p < 0,0005). (A) Dans le groupe 3, trois petits sous-groupes ont été identifiés associés à l'endocytose, à l'endocytose médiée par les récepteurs et à la liaison et à la synthèse des lipides (à l'extrême gauche); un deuxième sous-groupe est centré sur l'endocytose synaptique (groupe intermédiaire) ; et un troisième implique le transport des vésicules (extrême droite). (B) Dans le groupe 5, un sous-groupe de termes a été identifié couvrant l'autophagie, l'autophagie médiée par les récepteurs et la régulation de ces deux termes (à l'extrême gauche) ; un deuxième groupe plus important identifie l'endocytose et l'endocytose médiée par les récepteurs, les processus liés à la régulation autophagique, ainsi que le transport vésiculaire. (C) Dans le groupe 6, trois sous-réseaux ont été identifiés dans l'espace ELN, démontrant l'endocytose active, les processus lysosomiques et le transfert entre ces compartiments et le réseau trans-golgi (à gauche). Un deuxième grand groupe de termes a été identifié, associé à la fonction immunitaire innée, à l'activation et à la régulation, ainsi qu'aux processus inflammatoires liés (côté droit).

(A) UMAP de regroupement non biaisé sur 13 échantillons d'individus APOE ε3 / ε3 uniquement montre 9 grappes. (B) Semblable aux grappes identifiées dans l'ensemble de données sur le génotype APOE mixte, les grappes identifiées dans l'ensemble de données sur le génotype APOE ε3/ε3 sont distinctes par l'expression génique. Les 5 premiers gènes sont affichés pour chaque cluster. (C) Diagrammes de Venn démontrant le chevauchement entre les groupes des cohortes mixtes APOE et APOE ε3/ε3 démontrant un chevauchement significatif dans les profils d'expression génique.

Ce sont les facteurs de transcription qui ont le plus souvent conduit à l'expression des gènes dans les groupes 4, 7, 9 et 10. Les valeurs indiquent le pourcentage de réplicats des permutations de l'ensemble de données où ce facteur de transcription était unique au groupe donné, avec une couleur plus foncée indiquant des pourcentages plus élevés . Notez que si quelques facteurs de transcription similaires sont observés dans plusieurs grappes, en particulier les facteurs de transcription les plus répandus sont uniques et sont représentatifs de l'expression génique conduisant les fonctions biologiques dans ces grappes.

Semblable à l'ensemble de données plus large, les facteurs de transcription à l'origine de l'expression des gènes au sein des clusters sont distincts lorsque les données sont composées uniquement de porteurs d'allèles APOE ε3/ε3.

Les cartes thermiques de : (A) l'ensemble de gènes endolysosomiques Gene Ontology (GO) démontrent une régulation à la hausse significative dans le groupe 6. (B) L'ensemble de gènes de récepteurs Toll-Like (TLR) de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) démontre une régulation à la hausse significative dans Cluster 8 comme on pouvait s'y attendre étant donné le phénotype inflammatoire classique observé dans l'expression génique. (C) La liste des gènes « Disease Associated Microglia » (DAM) de Keren-Shaul et al. 2017 montre une régulation à la hausse des gènes dans plusieurs clusters dans notre ensemble de données humaines. Cela reproduit d'autres études humaines qui n'ont pas identifié un seul cluster DAM contrairement aux études impliquant des modèles murins de la maladie d'Alzheimer.

(A) Un exemple représentatif de coloration observée dans plusieurs champs sur au moins trois humains montre une microglie activée avec à la fois un grand nombre de lysosomes (Lampe-1, blanc) et d'ADNdb cytosolique (magenta) dans un cas de MA (flèche remplie). (B) La microglie (pointe de flèche) sans immunoréactivité de l'ADNdb cytosolique (magenta) dans le même cas et la section de tissu apparaît ramifiée avec moins de signal de la lampe-1. Toutes les barres d'échelle représentent 15 microns.

(A) Les résultats de l'ensemble de données complet ont été reproduits dans la cohorte d'allèles APOE ε3/ε3 purs, ce qui suggère que plusieurs sous-populations existent dans le groupe « homéostatique ». Ces sous-populations sont distinctes par l'expression génique bien qu'elles soient composées d'une sous-population « homéostatique ». (B) Dans le groupe 1 "homéostatique" de la cohorte APOE ε3 / ε3, il existe un groupe 1.5 qui est significativement augmenté dans le cerveau AD comme nous l'avons trouvé dans la cohorte complète (Fig. 6; Chi-carré FDR corrigé p = 6,7673 × 10 −6). **= p < 0,01.

Tableaux supplémentaires 1 à 7.

Données supplémentaires pour l'ensemble de données sur le génotype APOE mixte de 22 échantillons, y compris les DEG par rapport à tous les autres clusters et par rapport au cluster HM, les voies pour chaque cluster identifié par GSEA et les résultats pseudobulk comparant AD aux cas témoins dans chaque cluster.

Données supplémentaires pour l'ensemble de données APOE ε3 / ε3 à 13 échantillons, y compris les DEG par rapport à tous les autres clusters et par rapport au cluster HM, les voies pour chaque cluster identifié par GSEA, le pourcentage de chevauchement des DEG avec les clusters de l'ensemble de données sur le génotype APOE mixte à 22 échantillons et les résultats pseudobulk comparant AD aux cas témoins dans chaque groupe.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Prater, KE, Green, KJ, Mamde, S. et al. La microglie humaine montre des changements transcriptionnels uniques dans la maladie d'Alzheimer. Nat Vieillissement (2023). https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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Reçu : 07 juillet 2022

Accepté : 25 avril 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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