Extraction et identification de nouveaux composés flavonoïdes dans le pissenlit Taraxacum mongolicum Hand.

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2166 (2023) Citer cet article

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En raison de l'intérêt pour l'application pharmacologique potentielle du pissenlit, les constituants chimiques et les activités de Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz ont été étudiés. La méthodologie de surface de réponse Box-Behnken a été utilisée pour optimiser le protocole d'extraction des flavonoïdes du pissenlit. Les structures moléculaires de différents composés flavonoïdes ont été acquises et analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) et spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Plusieurs composés flavonoïdes majeurs ont été isolés et purifiés, à savoir l'hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside, l'hespérétine-7-glucuronide, le kaempférol-3-glucoside, la baicaléine, l'hyperséroside, extraits pour la première fois du pissenlit. L'hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside a été identifiée comme un nouveau type de flavonoïde qui n'avait jamais été signalé dans la littérature. Ce nouveau flavonoïde a une activité antioxydante exceptionnelle, comme le montre sa valeur IC50 (8,72 mg/L) pour piéger les radicaux libres DPPH. La détermination des activités antioxydantes liées à la structure pourrait être interprétée sur la base des calculs DFT. Ainsi, nous avons non seulement illustré la richesse en flavonoïdes de Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz, mais également révélé de nouveaux types de composés flavonoïdes dans le pissenlit en termes de structure et de propriétés antioxydantes.

Le pissenlit Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz (T. mongolicum Hand.-Mazz) est une plante herbacée vivace qui peut être utilisée à la fois comme médicament et comme aliment1. Il appartient aux compositae, alias Huanghuading, ou popoding comme indiqué dans la deuxième édition de la Pharmacopée chinoise2. De nos jours, l'application du pissenlit est en augmentation et la recherche sur sa composition chimique et son action pharmacologique attire de plus en plus l'attention3. Généralement, le pissenlit contient une variété de composants biologiquement actifs, notamment des flavonoïdes, des triterpènes, des sesquiterpènes, des acides phénoliques, des stérols et des coumarines, à haute valeur comestible et médicinale4. En particulier, le pissenlit possède des activités pharmacologiques antibactériennes, anti-inflammatoires, antioxydantes, hépatoprotectrices et antitumorales5. Les flavonoïdes sont une classe des principaux composants bioactifs du pissenlit, qui est étroitement associée aux effets pharmacologiques du pissenlit. Par exemple, les effets médicinaux du pissenlit tels que les propriétés anticancéreuses, anti-âge, hépatoprotectrices, cholagogues et bactériostase, sont directement ou indirectement liés aux activités des flavonoïdes6.

Ces dernières années, de nombreuses études ont exploré les effets pharmacologiques et l'application clinique des préparations brutes de pissenlit, alors qu'il est nécessaire d'étudier les effets pharmacologiques de composés chimiques uniques tels que les flavonoïdes du pissenlit. Yanghee et al. ont mené des études expérimentales sur l'effet médicinal de l'extrait aqueux de racine de pissenlit de T. mongolicum7. Yuldashev et al. des flavonoïdes isolés dont la lutéoline, la quercétine et leurs dérivés issus des racines du pissenlit médicinal (T. officinale Wigg.)8. Shi et al. a obtenu de l'artémisinine et de la quercétine à partir de pissenlit de T. Mongolian et a identifié deux nouveaux flavonoïdes, à savoir l'isoétine-7-O-β-d-glucopyr-anosyl-2′-0-al-arabinopyranoside, l'isoétine-7-0-β-d -gluco9. En général, les flavonoïdes proviennent de composants métaboliques secondaires des plantes, qui sont très importants en phytochimie10,11. En termes de structure chimique, il existe différents composés flavonoïdes dans lesquels le cycle aromatique A fusionne avec le cycle pyranone C, puis se connecte à un autre cycle aromatique B, et possède les caractéristiques de squelette de base de C6-C3-C6. Il existe de nombreux sites de connexion entre le squelette de base du cycle C et du cycle B, et le cycle A et le cycle B ont souvent des substituants tels que hydroxyle, méthoxy, méthyle et isopenty, ce qui donne de nombreux dérivés et fonctions actives différents. La figure 1 illustre les structures parentales des flavonoïdes, tandis que les flavonoïdes dans les plantes existent principalement sous la forme de glycosides, c'est-à-dire de groupes hydroxyle liés à des unités de sucre et à deux cycles aromatiques (A et B). De nombreuses études ont prouvé que la valeur médicinale du pissenlit a une relation étroite avec l'activité antioxydante du flavonoïde de pissenlit13,14. Cependant, les composés flavonoïdes du pissenlit sont complexes et il manque une analyse complète des flavonoïdes du pissenlit en termes de structure et d'activité antioxydante. Par conséquent, il est très intéressant d'explorer les différentes formes et activités antioxydantes des composés flavonoïdes du pissenlit et d'analyser la relation structure-activité correspondante.

Principales structures parentales des flavonoïdes.

Dans ce travail, nous avons mené l'étude sur l'extraction et l'identification de nouveaux composés flavonoïdes dans le pissenlit Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz. et évalué leurs activités antioxydantes. La figure 2 illustre schématiquement la procédure expérimentale. L'extraction des principaux composés flavonoïdes a été optimisée à partir de Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz en utilisant la méthodologie de surface de réponse. Ensuite, ces composés ont été purifiés par chromatographie liquide à haute performance (PHPLC) et analysés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) et spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Les structures composées ont été déterminées sur la base de données expérimentales et également confirmées par des calculs théoriques basés sur la théorie de la fonction de densité (DFT). Les activités antioxydantes des composés flavonoïdes extraits ont été évaluées sur la base de l'évaluation de la capacité de piéger les radicaux libres DPPH. La relation structure-activité des composés flavonoïdes intéressés y a été explorée et discutée.

Diagramme schématique démontrant nos recherches sur l'extraction, la purification, l'identification structurelle et l'évaluation antioxydante des composés flavonoïdes de Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.

Toutes les expériences ont été réalisées via le schéma expérimental d'optimisation de surface de réponse de conception Design-Expert. Selon le modèle de surface de réponse, les conditions d'extraction optimales ont été obtenues comme suit : temps d'extraction 70 min, rapport liquide-matière 52,56:1 (mL/g), température d'extraction 80 °C (les paramètres pour l'optimisation de la surface de réponse sont fournis dans Tableau S1 et Tableau S2), et le rendement théorique en flavonoïdes totaux du pissenlit était de 13,31 % selon la méthode rapportée précédemment15. Compte tenu de l'opération simple et pratique, le processus d'extraction optimal des flavonoïdes totaux du pissenlit était de 70 min, le rapport liquide sur matériau était de 53:1 (mL/g) et la température d'extraction était de 80 °C. Chaque expérience a été répétée au moins trois fois dans les mêmes conditions. À noter, les expériences à facteur unique ont été initialement menées pour étudier l'effet de facteurs liés sur le résultat étudié (Fig. S1). En conséquence, le rendement moyen des flavonoïdes totaux de pissenlit était de 14,12 % et l'erreur relative avec la valeur théorique (13,31 %) était de 5,74 %, et la capacité de prédiction et la faisabilité du modèle répondent aux attentes réelles (Fig. 3) . L'équation polynomiale quadratique a été utilisée pour l'ajustement par régression multiple : Y = 11,74 + 0,33A + 0,49B + 0,85C − 0,037AB + 0,59AC − 0,21BC + 0,071A2 − 0,98B2 − 0,29C2.

Surfaces de réponse d'extraction avec des changements de facteurs variables : (A) Résultat d'extraction en fonction du temps et du rapport liquide/matériau, avec une température fixe (80 °C). (B) Résultat d'extraction en fonction du temps et de la température, avec un rapport liquide/matériau fixe (52,56:1 (mL/g)). (C) Résultat d'extraction en fonction du rapport liquide/matière et de la température, avec un temps fixe (70 min).

Les tableaux S1 et S2 listent les paramètres du raccord. A, B, C, AC, B2 ont eu un effet significatif sur le rendement total en flavonoïdes (P < 0,01), tandis que AB, BC, A2, C2 n'ont eu aucun effet significatif sur le rendement total en flavonoïdes (P > 0,05).

Dans notre étude, sept composés flavonoïdes principaux ont été extraits et purifiés du pissenlit, qui ont ensuite été identifiés comme étant l'hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside (Composé I), la quercétine (Composé II), l'hespérétine-7-glucuronide (Composé III) , kaempférol-3-glucoside (Composé IV), baicaléine (Composé V), hyperséroside (Composé VI) et rutine (Composé VII) (voir les détails dans les Fig. S2 à S18 pour les preuves expérimentales). Parmi eux, un nouveau type de flavonoïde a été pour la première fois identifié, à savoir l'hespérétine-5'-O-β-rhamnoglucoside (Composé I), car il n'avait jamais été rapporté dans la littérature. La figure 4 montre le chromatogramme des ions totaux et le spectre MS du nouveau composé I. Le temps de pic du composé I est de 1,011 min. Le spectre de masse de la chromatographie liquide présentait un rapport d'ions moléculaires m/z calculé pour C28H34O15 (610,56 ([M−H]– : 609,15), m/z 447,1, 285,0 (pic de base)). Il a été déterminé que le composé était un flavonoïde en fonction de ses propriétés physicochimiques et du signal du spectre ultraviolet.

Modèle de pic LC-MS et modèle LC-MS2 M/Z correspondant.

Les structures des composés flavonoïdes extraits ont été déterminées par RMN. La figure 5 montre le spectre d'hydrogène 1D et le spectre HSQC 2D pour le composé I. Les pics singulet à 12,03 ppm et 9,11 ppm représentent deux protons provenant de l'hydroxyle phénolique. Le multiplet à 6,94–6,11 ppm pour cinq protons forme un cycle aromatique et un autre multiplet à 5,52–4,46 ppm représentant treize protons du –CH cyclique (cycle glycone) a également été observé. Les pics singulet à 3,78–3,64 ppm représentent les trois protons du groupe –OCH3 et un multiplet à 3,66–2,77 pour le groupe hydroxyle alicyclique, et un doublet à 2,29 ppm pour deux protons du groupe –CH2OH attachés au cycle glycone et le singulet représentant trois des protons à 1,15–1,05 ppm pour –CH3 ont également été trouvés. Le spectre RMN 13C a montré des signaux de carbone à (HSQC, 125 MHz, δ ppm) : 145,93, 144,24, 131,81, 117,80, 114,07, 111,90, 103,29, 100,35 et 96,22 ppm représentaient des atomes de carbone aromatiques. Les pics à 87,32, 82,42, 78,39, 73,00, 71,75 et 70,11 ont été attribués aux carbones alicycliques. Les deux carbones du groupe CH2OH et un groupe méthyle attaché au cycle glycone étaient représentés à 28,36 et 18,02 ppm respectivement. Le carbone oxyméthine et les carbones éthylène aliphatiques étaient représentés à 74,11 et 32,51 ppm respectivement. Le carbone méthoxy était représenté à 49,33 ppm. Il a été déterminé comme hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside.

Spectres 1H et spectres RMN 13C HSQC du nouveau Composé I.

De plus, la structure du nouveau composé a été confirmée en utilisant le calcul DFT avec b3lyp/6-311 g (d, p). Pour déterminer la structure optimale du composé I, les données 1H et 13C ont été calculées en utilisant la méthode DFT/GIAO via le programme Gauss 09 en utilisant b3lyp/6-311+g (2d, p) (tableau 1). Les valeurs de déplacement chimique données par DFT/B3LYP sont très proches des données expérimentales, vérifiant davantage la détermination de la structure moléculaire du Composé I.

Le nouveau composé flavonoïde (I) est une substance poudreuse blanche, qui peut être dissoute dans du méthanol et de l'acétone. Il a ainsi été dosé en hespérétine-5′-O-β-rham-noglucoside, (2-[3-[3, 4-dihydroxy-6-méthyl-5-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxyméthyl ) oxan-2-yl] oxyoxan-2-yl]oxy-4-h-ydroxy-5-méthylph-ényl]-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromène-4-one) (Fig. 6 ).

La structure du nouveau composé flavonoïde (Composé I), l'hespérétine-5'-O-β-rhamnoglucoside.

Les activités antioxydantes des composés flavonoïdes ont été évaluées par le test de piégeage des radicaux DPPH. Le DPPH est stable et facile à manipuler, ce qui est souvent utilisé pour évaluer l'activité des radicaux libres dans le piégeage des antioxydants16. La figure 7 montre l'évolution de l'absorption dans le processus de réaction du nouveau composant oxydant réactif avec le DPPH. L'absorbance à 517 nm a diminué avec l'augmentation de la concentration, montrant l'efficacité de piégeage du nouveau composé.

Spectres UV–Vis du complexe hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside-DPPH· avec concentration en oxydant.

Pour la comparaison de la capacité antioxydante, on a mesuré la CI50 qui est la concentration du demi-taux d'inhibition, c'est-à-dire la concentration de piégeur lorsque le taux de piégeage des radicaux libres est de 50 %. Plus la valeur IC50 est petite, plus l'effet de piégeage ou la capacité antioxydante est fort17,18. La figure 8 montre les résultats que l'IC50 des sept flavonoïdes de la séquence : quercétine (8,07 ± 0,67 mg/L) < hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside (8,72 ± 0,88 mg/L) < kaempférol-3-glucuronide (13,49 ± 1,02 mg/L) < baicaléine (15,5 ± 0,98 mg/L) < hespérétine-7-glucuronide (22,1 ± 0,76 mg/L) < hyspéroside (31,39 ± 0,65 mg/L) < rutine (31,54 ± 0,79 mg/ L) (Fig. S19 ; Tableau S3).

Comparaison de la valeur IC50 du nouveau flavonoïde (Composé I) avec d'autres composés flavonoïdes extraits. Toutes les mesures ont été faites en triple, et les valeurs IC50 sont présentées sous forme de moyenne ± écart type dans le tracé.

Les structures moléculaires de sept flavonoïdes sont présentées sur la figure 9. L'activité du groupe hydroxyle phénolique dans le cycle A est la plus faible, tandis que celle du cycle B est la plus élevée. Le groupe ortho-disubstitué dans le cycle B est le groupe antioxydant nécessaire des flavonoïdes, en particulier lorsqu'il est substitué par un groupe hydroxyle phénolique19, et l'activité antioxydante de la substitution 3-OH dans le cycle C est particulièrement importante, parmi lesquelles la glycosylation de 3-OH dans le cycle C est défavorable, et plus le degré de glycosylation est fort, plus l'activité antioxydante est mauvaise. Par conséquent, l'activité antioxydante est dans l'ordre suivant : quercétine > hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside > hespérétine7-glucuronide, car l'encombrement stérique du grand groupe glycoside joue un rôle majeur dans la protection ou l'inhibition du 3, 4-OH du cycle B, entraînant une réduction de son activité antioxydante20. Catherine et al.21 ont également montré que le 3-OH du cycle C est très important car le groupe hydroxyle en position C-3 peut être isomérisé avec la double liaison en position C-2 et 3 pour former une forme dicétone, produisant une forme hautement active. Le groupe CH et le cycle C insaturé étendent le système conjugué du cycle A et du cycle B, ce qui rend le radical phénoxy plus stable et améliore son activité antioxydante. Chun et al.22 ont montré que la quercétine et la myricétine ont une forte activité antioxydante grâce à cette structure.

Structures des composés flavonoïdes extraits.

Les résultats expérimentaux ont montré que les glycosides 3-OH du cycle C réduisaient l'activité antioxydante des flavonoïdes en piégeant les radicaux libres DPPH. Plus le nombre de glycosides substitués est élevé, plus l'activité antioxydante est faible, de sorte que l'activité antioxydante des flavonoïdes substitués par des monoglycosides est meilleure que celle des diglycosides. De ce fait, l'activité antioxydante est dans l'ordre : kaempférol-3-glycoside > hespéridine > rutine. De plus, il a été constaté que la position du groupe hydroxy phénolique avait plus d'influence sur la différence d'activité antioxydante que le nombre de groupes hydroxyle phénoliques. L'existence du groupe hydroxyle phénolique du cycle B a grandement amélioré l'activité antioxydante, et l'ajout du substituant glycoside du cycle B a un effet positif sur l'activité antioxydante23,24, de sorte que l'activité antioxydante de la substitution glycoside du groupe hydroxyle cyclique C serait défavorable dans l'antioxydant capacité. Par conséquent, l'activité antioxydante de la baicaléine est supérieure à celle du kaempférol-3-glycoside.

De plus, les coefficients de corrélation orbitale de première ligne peuvent être utilisés pour caractériser l'activité antioxydante moléculaire dans les calculs de chimie quantique25,26. Selon la théorie des orbitales moléculaires, les orbitales frontières comprennent l'orbite occupée la plus élevée et l'orbite vide la plus basse, qui sont étroitement liées à la réactivité des molécules. L'énergie orbitale occupée la plus élevée (HOMO) caractérise la capacité des molécules à donner des électrons, c'est-à-dire que plus l'HOMO est grand, plus la capacité à donner des électrons des molécules est forte. L'énergie orbitale vide la plus basse (LOMO) caractérise la capacité des molécules à accepter des électrons, c'est-à-dire que plus le LOMO est petit, plus la capacité des molécules à accepter des électrons est forte27,28. La différence de niveau d'énergie orbitale de première ligne Δ E (Δ E = LUMO – HOMO) caractérise l'énergie requise par les molécules de l'état fondamental à l'état excité. Plus la différence de niveau d'énergie est petite, plus la transition des électrons est facile, donc plus la réactivité des molécules est forte29. Les niveaux d'énergie orbitale frontière de trois molécules de différence avec la plus forte résistance à l'oxydation ont été calculés. Selon les données du tableau 2, le niveau d'énergie HOMO (- 5,738656 eV) de l'hespérétine7-glucuronide est supérieur à celui des deux autres composés, et les électrons de cette orbitale sont les plus instables et les plus faciles à perdre. Du point de vue de ΔE = (LUMO–HOMO), la gamme d'énergie moléculaire est de l'ordre de ΔE (hespérétine7-glucuronide) > ΔE (hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside) > ΔE (quercétine). Les résultats calculés sont en bon accord avec les résultats expérimentaux (tableau S3). Les résultats montrent que la différence de niveau d'énergie orbitale moléculaire frontière peut être utilisée comme paramètre théorique fiable pour prédire l'activité de piégeage des radicaux libres des flavonoïdes dans le même type de molécules30.

De plus, selon la théorie de la dynamique moléculaire, la rupture de la liaison chimique doit absorber de l'énergie, de sorte que les molécules puissent se déplacer d'une surface d'énergie potentielle à une autre avec une surface d'énergie potentielle plus élevée31,32.

On peut voir à partir de l'orbitale moléculaire (HOMO) (comme le montre la figure 10) qu'il existe de nombreux nuages d'électrons dans l'anneau B, qui est le principal site de réaction chimique33. Le paramètre physique et chimique le plus essentiel est la différence entre la chaleur de formation des radicaux libres produits par les antioxydants et la réaction d'extraction de l'hydrogène OHF (l'énergie de dissociation de la réaction d'extraction de l'hydrogène), c'est-à-dire que l'activité antioxydante des flavonoïdes consiste à générer des radicaux phénoxy après extraction d'hydrogène des molécules mères34. Des études ont montré que le cycle B des flavonoïdes est le site actif de la réaction (Fig. S20) et que l'ortho-substitution peut renforcer l'activité du cycle B35,36.

Carte de distribution HOMO de l'orbitale frontière du nouveau flavonoïde. La couleur rouge représente la partie positive de l'orbitale moléculaire, tandis que la couleur verte représente la partie négative.

Les trois composés flavonoïdes ont le même substituant en position 4 'et différents substituants en 3', de sorte que l'énergie donnant de l'hydrogène du groupe fonctionnel en position 3' a été calculée (Fig. 11). Sur la base des structures moléculaires optimisées, l'analyse comparative de l'enthalpie de la réaction d'extraction d'hydrogène a également été réalisée. Les résultats du calcul de la variation d'enthalpie d'extraction d'hydrogène du substituant en position carbone 3′ du cycle B sont les suivants : quercétine (22,5 kcal/mol) < hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside (43,1 kcal/mol) < hespérétine-7-glucuronide (44,2 kcal/mol). Les résultats montrent que le groupe ortho-hydroxyle du cycle B a la plus forte activité, principalement parce qu'il peut effectuer la deuxième réaction continue de piégeage des radicaux libres37,38. Par conséquent, les résultats de la prédiction théorique sont cohérents avec les résultats expérimentaux, montrant que la méthode DFT peut fournir des orientations théoriques pour le dépistage des flavonoïdes antioxydants naturels.

Comparaison des barrières de déshydrogénation pour trois composés flavonoïdes avec des substituants ortho 3 'du cycle B.

En conclusion, sept flavonoïdes majeurs ont été extraits et isolés de toute l'herbe de pissenlit Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz. par un protocole d'extraction optimisé. L'hespérétine-5'-O-β-rhamnoglucoside est un nouveau type de flavonoïde qui a été découvert pour la première fois dans ce travail. Les activités antioxydantes contre le DPPH ont été évaluées et comparées. En général, les flavonoïdes ont une forte activité de piégeage des radicaux libres. Le mécanisme de piégeage du DPPH in vitro est que les substituants sur le cycle des flavonoïdes, tels que l'hydroxyle et le méthoxy, réagissent avec les radicaux libres. Les niveaux d'énergie orbitale moléculaire des composés flavonoïdes ayant une activité antioxydante plus forte et l'enthalpie d'extraction d'hydrogène des substituants du cycle B ont été reconfirmés par le calcul DFT. Les résultats théoriques sont cohérents avec les résultats expérimentaux, confirmant que l'hespérétine-5′-O-β-rhamnoglucoside a une activité antioxydante plus forte principalement en raison de l'effet combiné de différents substituants dans le cycle B, ainsi que de la capacité accrue d'apport d'hydrogène. Étant donné que ces composés sont extraits de plantes médicinales naturelles et comestibles et qu'ils peuvent être utilisés en toute sécurité comme antioxydants dans les industries alimentaires et cosmétiques, ces travaux ont non seulement révélé de nouveaux composés flavonoïdes dans le pissenlit, mais peuvent également suggérer une nouvelle source de potentiel pharmacologique. nutriments.

Des échantillons de pissenlit (Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz) ont été prélevés dans la ville de Wulanchabu, en Mongolie intérieure. L'espèce a été identifiée par Yuan Ke Yan (inspecteur du Hohhot Food and Drug Inspection and Testing Center). Le matériel expérimental était le pissenlit entier broyé, y compris la feuille, la tige et la racine. D'autres produits chimiques ont été achetés, notamment : étalon de rutine (pureté HPLC ≥ 98 % Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.), éthanol absolu (AR Sinopharm), acide acétique (AR Sinopharm), résine polyamide (14–30 mesh Sinopharm) , acétone (AR Xilong), méthanol (AR Xilong), DMSO-d6 (pureté > 99,9 %, Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.).

Dans cette expérience, les flavones totales de pissenlit ont été extraites par la méthode d'extraction à chaud à l'éthanol. Le pissenlit séché broyé de 1 kg a été étudié sur la base d'une concentration d'éthanol de 60 %, d'un temps d'extraction de 30 min, d'un rapport de matière liquide de 20:1 (mL : g) et d'une température d'extraction de 50 °C. Pour optimiser l'extraction des flavonoïdes de pissenlit, d'une part, des expériences à facteur unique ont été menées, avec le changement du temps d'extraction (30, 40, 50, 60 et 70 min), de la température d'extraction (40, 50, 60 et 80 °C), et /ou le rapport liquide/matière (20, 30, 40, 50 et 60:1 (v/w) mL/g) et la concentration d'éthanol (40 %, 50 %, 60 %, 70 % et 80 % (v /w)). Un facteur a été modifié tandis que les autres ont été maintenus constants dans chaque expérience. La conception de Box – Behnken (BBD) a été utilisée pour déterminer la meilleure combinaison de différentes variables afin de maximiser l'extraction des flavonoïdes sur la base des résultats expérimentaux à facteur unique. La plage appropriée pour le temps d'extraction (A) et le rapport liquide / matériau ont été sélectionnés (B), la température d'extraction (C) a été déterminée, puis la méthodologie de surface de réponse a été utilisée pour concevoir les conditions expérimentales. Les variables indépendantes et leurs niveaux sont donnés dans le tableau 3. Sur la base des données BBD, un modèle polynomial quadratique a été ajusté pour corréler la relation entre les variables indépendantes et les valeurs de réponse afin de prédire les conditions optimisées.

La teneur totale en flavonoïdes a été déterminée selon la méthode décrite précédemment de de la Rosa39. 1 mL de chaque échantillon (250 µg/mL dissous dans du méthanol) a été additionné de 0,3 mL de nitrite de sodium (5 %, p/v) et de nitrate d'aluminium (10 %, p/v), bien agité et laissé reposer pendant 5 min. Ensuite, 4 ml d'hydroxyde de sodium (4 %, p/v) ont été ajoutés sans exposition directe à la lumière et la solution résultante a été laissée au repos pendant 30 min. La solution d'échantillon a été évaluée à l'aide d'un lecteur de microplaque UV-Vis et de l'absorbance à 510 nm. Après avoir mesuré l'absorbance de l'extrait avec la même méthode, la concentration massique en flavonoïdes totaux a été calculée selon l'équation de régression obtenue39 : Rendement total en flavonoïdes (%) = C × V × N/M × 100 %, où C est la masse concentration de flavonoïdes totaux dans l'extrait de pissenlit, mg/mL ; V est le volume d'extrait de pissenlit, mL; N est le taux de dilution ; M est la masse de poudre de pissenlit sec, mg). La teneur totale en flavonoïdes a été présentée en équivalents de catéchine par gramme de chaque échantillon.

Après avoir été activée avec une résine macroporeuse polyamide (en bas) + une résine macroporeuse AB-8 (en haut), la solution d'échantillon a été placée dans une colonne de séparation en verre pour une séparation initiale. 42,7 g d'extrait brut ont été divisés en trois parties en moyenne, éluées avec 4,2 L de méthanol à 70 %, d'acétone et d'éthanol à 60 % (rapport volumique : 300 mL : 1 g) respectivement. Tous les 500 ml d'éluant ont été collectés sur une colonne chromatographique Shimadzu LC-16P. Une colonne chromatographique YMC Pack ODS-A a été utilisée et SPD-20A a été utilisé comme détecteur. La phase mobile était un système binaire, la phase A était de l'eau contenant 0,1 % d'acide formique et la phase B était de l'acétonitrile. Dans de l'eau contenant 0,1 % d'acide formique, la procédure d'élution par gradient a été appliquée avec les paramètres définis comme suit : 0–2 min, 20 % B ; 2–7 min, 60 % B ; 7–10 min, 75 % B ; 10–14 min, 35 % B ; 15–17 min, 20 % B.

Différents composés flavonoïdes ont été analysés par AB Triple TOFTM 5600 + LC-MS/MS (SCIEX, ShangHai, Chine) qui a été activé avec une vitesse de balayage ultra-rapide et une résolution de spectrométrie de masse élevée et une sensibilité quantitative, garantissant que le système peut obtenir une masse de haute précision données de spectrométrie et limites de détection quantitatives. La séparation des substances flavonoïdes en chromatographie liquide a été réalisée à l'aide d'une colonne en phase inverse C18 (100 mm × 4,6 mm, taille de particules de 5 µm) avec une température de colonne de 25 ℃. La phase mobile est constituée de 0,1 % d'acide formique dans de l'eau (A) et de 100 % d'acétonitrile (B) et le débit était de 0,3 mL/min. Les paramètres de gradient pour le programme d'élution étaient les suivants : 0 à 1 min, 95 % A ; 1–20 min, 95–70 % A ; 20–30 min, 70–10 % A ; 30–35 min, 10 % A ; 35 à 36 minutes, 10 à 95 % A ; 36–40 min, 95 % A. Le volume d'injection était de 10 µL (concentration inconnue). Le spectre de masse a été obtenu sur une source d'ionisation électrospray chauffée en modes ions négatifs. Les paramètres clés étaient les suivants : la tension de pulvérisation était de + 3,8 et - 2,8 kV et le débit de gaz gaine était de 35 unités arbitraires (unité arb) ; le débit de gaz auxiliaire était de 10 unités arb ; la température capillaire était de 325 °C et la température du réchauffeur de gaz auxiliaire était de 350 °C. La plage de balayage était de m/z 100 à 100 000, ce qui couvre le poids moléculaire des flavonoïdes. L'acquisition et le traitement des données ont été effectués avec Mass Frontier 7.0 et le logiciel Xcalibur 4.1 (Waltham, MA, Thermo Scientific), respectivement. Pour l'analyse RMN, les spectres ont été obtenus à l'aide de spectromètres Bruker AV-500 (500 MHz pour la RMN 1H et 125 MHz pour la RMN 13C) (Bruker, Suisse). De plus, une spectroscopie ultraviolette visible (UV–Vis) a également été réalisée sur le spectrophotomètre UV–Vis Shimadzu UV-2550 (200–800 nm) pour l'analyse des composés.

Pour le dosage antioxydant, les composés ont été testés contre l'oxydant standard DPPH. 25 mg de DPPH ont été dissous dans 100 ml d'éthanol absolu pour obtenir une solution mère, et une série de solutions d'échantillons d'extrait de différentes concentrations (0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 mg/L) ont été préparé. Pour la mesure de l'activité antioxydante, la valeur d'absorbance à 517 nm a été mesurée après réaction, et toutes les expériences ont été répétées trois fois. La capacité de piégeage des radicaux DPPH a été calculée comme suit : activité de piégeage du DPPH· (%) = [1 − (As − Ab)/Ad] × 100 %, où Ad est la valeur d'absorbance de 4 mL 50 mg/L de DPPH, As is la valeur d'absorbance de la solution de 4 ml de solution d'éthanol DPPH à 50 mg/l plus 1 ml d'échantillon, et Ab est la valeur d'absorbance de 4 ml de solution d'éthanol absolu plus 1 ml de solution d'échantillon. L'évaluation et la comparaison de la capacité de piégeage des radicaux libres des antioxydants est basée sur la valeur IC50, qui correspond à la concentration de la solution antioxydante lorsque le taux de piégeage des radicaux DPPH· est de 50 %40.

Des calculs ont été effectués pour faciliter la compréhension et la confirmation des résultats expérimentaux, y compris les structures, les activités antioxydantes et les spectres. Tous les calculs ont été effectués à l'aide du package Gaussian 09. Les calculs de ce travail ont été effectués en appliquant les fonctionnelles B3LYP avec l'ensemble de base 6-311G++(d, p). Les calculs ont donné lieu aux niveaux d'énergie et aux plages d'énergie de l'orbite occupée la plus élevée (HOMO) et de l'orbite vide la plus basse (LUMO) des produits avec les trois premières résistances à l'oxydation, ainsi que l'enthalpie d'extraction d'hydrogène des substituants du cycle B41. De plus, les spectres RMN 1H et 13C ont été calculés sous la condition Opt + Freq/GIAO42.

L'étude est conforme aux directives et réglementations en vigueur.

Toutes les données générées ou analysées au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n ° 11635013) et le programme d'intégration de la recherche des instituts Hefei des sciences physiques, Académie chinoise des sciences.

Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, numéro de subvention : 11635013.

Institut des machines intelligentes, Institut Hefei d'agriculture intelligente, Instituts Hefei des sciences physiques, Académie chinoise des sciences, Hefei, 230031, Chine

Rong Wang, Cao Fang, Xinxin Zheng, Chao Liu et Qing Huang

Science Island Branch of Graduate School, Université des sciences et technologies de Chine, Hefei, 230026, Chine

Rong Wang, Cao Fang, Xinxin Zheng, Chao Liu et Qing Huang

École d'ingénierie de l'environnement et de l'énergie, Université Anhui Jianzhu, Heifei, 230601, Chine

Rong Wang et Weihua Li

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Correspondance avec Qing Huang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

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Reçu : 18 novembre 2022

Accepté : 24 janvier 2023

Publié: 07 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28775-x

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