Le vermillon et le cinabre sont impliqués dans la biosynthèse des pigments ommochromes dans les yeux mais pas dans les ailes des papillons Bicyclus anynana

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9368 (2023) Citer cet article

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Si le même pigment se trouve dans différents tissus d'un corps, il est naturel de supposer que les mêmes voies métaboliques se déploient de manière similaire dans chaque tissu. Nous montrons ici que ce n'est pas le cas pour les ommochromes, les pigments rouges et orange présents dans les yeux et les ailes des papillons. Nous avons testé l'expression et la fonction du vermillon et du cinabre, deux gènes de mouches connus dans la voie ommochrome, dans le développement de pigments dans les yeux et dans les ailes des papillons Bicyclus anynana, les deux traits ayant des pigments rougeâtres/oranges. En utilisant l'hybridation fluorescente in situ (HCR3.0), nous avons localisé l'expression du vermillon et du cinabre dans le cytoplasme des cellules pigmentaires des ommatidies, mais n'avons observé aucune expression claire pour l'un ou l'autre des gènes sur les ailes des larves et des pupes. Nous avons ensuite perturbé la fonction des deux gènes, en utilisant CRISPR-Cas9, ce qui a entraîné la perte de pigment dans les yeux mais pas dans les ailes. En utilisant la chromatographie sur couche mince et la spectroscopie UV-vis, nous avons identifié la présence d'ommochrome et de précurseurs d'ommochrome dans les écailles orange des ailes et dans l'hémolymphe des pupes. Nous concluons que les ailes synthétisent localement des ommochromes, avec des enzymes encore non identifiées, ou incorporent ces pigments synthétisés ailleurs à partir de l'hémolymphe. Différentes voies métaboliques ou mécanismes de transport conduisent ainsi à la présence d'ommochromes dans les ailes et les yeux des papillons B. anynana.

Les ommochromes sont des pigments rouges / orange trouvés dans une variété d'espèces qui remplissent diverses fonctions. Ils sont présents dans les cellules pigmentées des crustacés, des araignées et des insectes et jouent un rôle important dans la structuration des couleurs, le filtrage visuel, la protection UV et la détoxification du tryptophane1. Les ommochromes présents dans les cellules pigmentaires des ommatidies des insectes, l'unité optique des yeux des insectes, jouent un rôle important dans la protection des cellules photoréceptrices et dans la pigmentation globale des yeux1,2,3. Les ommochromes trouvés dans les taches de couleur rouge et orange dans les ailes des papillons, tels que les papillons Elymnias hypermnestra tinctoria4, Junonia coenia5,6 et Agraulis vanilla7, jouent probablement un rôle d'attraction du partenaire ou d'évitement des prédateurs.

Les ommochromes sont produits via la voie de biosynthèse des ommochromes, dont les enzymes ont été principalement étudiées dans les yeux de systèmes modèles d'insectes tels que Drosophila melanogaster8, Tribolium castaneum9, Aedes aegypti10 et les lépidoptères Bombyx mori11 et Plutella xylostella12. Dans cette voie, l'acide aminé tryptophane est converti en pigments xanthommatine et dihydro-xanthommatine qui peuvent être jaunes à rouges selon l'environnement réducteur de la cellule13. Chez la drosophile, quatre gènes clés codant pour différentes enzymes dans cette voie comprennent le vermillon, la kynurénine formamidase (kfase), le cinabre et le cardinal12. Une fois le tryptophane incorporé dans les cellules pigmentaires par le transporteur de monocarboxylate putatif karmoisine14, le vermillon code pour la tryptophane oxygénase qui convertit le tryptophane en formylkynurénine15. la kynurénine formamidase (kfase) code pour une enzyme éponyme qui convertit la formylkynurénine en kynurénine16. le cinabre code pour la kynurénine 3-hydroxylase qui convertit la kynurénine en 3-hydroxykynurénine12. Enfin, cardinal code pour la phénoxazinone synthétase qui catalyse la conversion de la 3-hydroxykynurénine en xanthommatine (orange), qui peut ensuite être convertie en dihydro-xanthommatine (rouge), dans des conditions chimiques réductrices13.

Certains des mêmes gènes codant pour les enzymes ommochromes, des précurseurs de métabolites ommochromes et un régulateur du facteur de transcription ommochrome oculaire ont également été identifiés dans les ailes de quelques espèces de papillons nymphalidés. Chez Vanessa cardui, le tryptophane est incorporé dans les domaines de couleur rouge et beige de l'aile17, et l'expression du vermillon et du cinabre est présente dans les zones pigmentées de couleur rouge des ailes Heliconius erato en développement18. Des études ultérieures ont identifié l'optix comme l'un des principaux facteurs de transcription régulant la présence de pigments ommochromes chez les papillons19, car son élimination a entraîné la perte de la pigmentation de couleur rouge et orange chez plusieurs espèces de papillons, ainsi que la régulation à la baisse de l'ommochrome. gènes associés à la voie dans les ailes20. Le rôle direct du vermillon et du cinabre dans la production de pigments ommochromes dans les ailes des papillons n'a cependant pas été testé.

Le lien entre l'optix et les gènes connus de la voie ommochrome n'est pas non plus clair chez les papillons Bicyclus anynana, qui, en raison de son génome séquencé et de nombreux outils génétiques pour l'expression et l'analyse fonctionnelle, constituent un bon système pour étudier une telle voie. optix est clairement impliqué dans la pigmentation des futures cellules de la cochenille orange dans les patrons de tache oculaire des ailes de cette espèce, car son knock-out entraîne la perte de la couleur orange21. Mais, on ne sait pas si les gènes connus de la voie ommochrome sont nécessaires à la production de pigment orange dans les ailes de B. anynana. le vermillon a été identifié dans l'extrait d'ARNm en vrac des ailes de nymphose de B. anynana à quelques moments22, mais les knockouts de vermillon utilisant CRISPR-Cas9 n'ont montré aucun effet visible sur les ailes23. De plus, l'inactivation des transporteurs ommochromes blanc et écarlate n'a pas non plus produit de phénotype visible sur les ailes, bien qu'affectant la pigmentation ommatidienne23. Ces résultats peuvent indiquer (1) que les gènes de la voie ommochrome ne sont exprimés que dans un petit nombre de cellules sur l'aile de B. anynana (l'anneau orange dans les taches oculaires), qui jusqu'à présent n'ont pas été touchées par l'outil CRISPR ; (2) que les ommochromes ne sont pas les pigments orange de B. anynana ; ou (3) que les ommochromes ne sont pas produits dans les ailes de B. anynana, mais y sont plutôt transportés à partir d'autres cellules productrices d'ommochromes.

Pour examiner l'implication de gènes de pigments ommochromes connus dans les ailes de B. anynana, nous avons examiné l'expression et la fonction du vermillon et du cinabre en utilisant respectivement l'hybridation fluorescente in situ et CRISPR-Cas9. Nous avons également examiné l'expression et la fonction des deux gènes dans les yeux en développement, en tant que contrôle. Nos résultats indiquent que ces deux enzymes ommochromes sont essentielles pour la pigmentation des yeux mais ne jouent aucun rôle majeur dans la synthèse locale des pigments des ailes chez B. anynana. Ensuite, en utilisant la chromatographie sur couche mince et la spectrométrie UV-visible, nous avons identifié la présence de pigments ommochromes et de précurseurs ommochromes dans l'anneau orange des taches oculaires et dans l'hémolymphe de B. anynana, respectivement. Nous concluons que les pigments ommochromes sont soit incorporés dans l'aile à partir d'une autre source, soit que de nouvelles enzymes sont utilisées pour la synthèse des ommochromes dans le tissu alaire de ce papillon.

Pour identifier la localisation spatiale et les modèles d'expression du vermillon et du cinabre, nous avons d'abord testé le modèle d'expression dans les yeux en développement des papillons à l'aide de HCR3.024. Nous avons observé des domaines d'expression clairs et distincts dans le cytoplasme des cellules pigmentaires ommatidiennes pour les deux gènes (Figs. 1A – F, S1D, E).

Expression et fonction du vermillon et du cinabre dans les yeux de Bicyclus anynana à 77 % de développement pupal (PD) (120 h). Expression de (A) DAPI et (B) vermillon dans les yeux. (C) Expression fusionnée de DAPI et de vermillon. Expression de (D) DAPI et (E) cinabre dans les yeux. (F) Expression fusionnée de DAPI et de cinabre. Le DAPI est exprimé dans quatre noyaux des ommatidies et l'ARNm du vermillon et du cinabre est présent dans le cytoplasme de ces cellules. Yeux adultes (G) WT, (H) yeux croquants vermillon et (I) yeux croquants cinabre. les crispants vermillon ont montré des phénotypes mutants plus homogènes, tandis que les crispants cinabre ont montré des plaques de cellules avec une pigmentation manquante (flèche noire). (J) Des indels ont été trouvés près du site ciblé par l'ARN guide pour le vermillon (boîte rouge) et pour le cinabre (K).

Nous avons ensuite testé l'expression du vermillon et du cinabre dans les ailes larvaires et nymphales de B. anynana à l'aide de HCR24. il a déjà été démontré que le vermillon et le cinabre avaient une expression plus élevée à 40 à 55% de développement pupal chez Vanessa cardui et Heliconius erato17,18, nous avons donc examiné l'expression de ces gènes jusqu'à ce stade chez B. anynana. Nous nous attendions à un domaine d'expression au moins partiellement chevauchant celui d'optix, qui est exprimé dans l'anneau orange des taches oculaires au stade nymphal (Figs. 2K – M, 3K – M, S1, S2)21,25. Aucun des gènes, cependant, n'a montré de domaine d'expression spécifique dans les ailes (Figs. 2, 3). Cependant, à 77 % (120 h) et 92 % de PD (144 h), nous avons observé une légère intensité homogène plus élevée de fluorescence à travers les ailes, probablement due à l'autofluorescence de la chitine au cours des derniers stades de développement du développement des ailes nymphales, comme le montrent les colorations de contrôle. la même augmentation de la fluorescence (Figs. 2G–J,N,O, 3G–J,N,O).

Expression du vermillon dans les ailes larvaires et nymphales de Bicyclus anynana. Expression du vermillon dans les ailes larvaires (A et B), (C et D) 31 % développement pupal (PD) (48 h), (E et F) 61,5 % PD (96 h), (G et H) 77 % PD (120 h) et (I et J) 92 % PD (144 h). Aucun domaine spécifique d'ARNm vermillon n'a été observé dans les ailes. (K – M) Co-expression du vermillon et de l'optix (témoin positif) à 77 % PD (120 h). Expression du brin sens vermillon dans l'aile antérieure (N) et l'aile postérieure (O) à 77 % PD (120 h).

Expression du cinabre dans les ailes larvaires et nymphales de B. anynana. Expression du cinabre dans les ailes larvaires (A et B), (C et D) 31 % développement pupal (PD) (48 h), (E et F) 61,5 % PD (96 h), (G et H) 77 % PD (120 h) et (I et J) 92 % PD (144 h). Aucun domaine spécifique d'ARNm de cinabre n'a été observé dans les ailes. (K – M) Co-expression du vermillon et de l'optix (témoin positif) à 77 % PD (120 h). Expression du brin sens cinabre dans l'aile antérieure (N) et l'aile postérieure (O) à 77 % PD (120 h).

Pour vérifier si les gènes ommochromes sont transcrits dans les ailes nymphales PD (24 h) à 15 %, nous avons effectué une PCR sur l'ADNc de l'aile entière en utilisant des amorces spécifiques au vermillon, au cinabre et à la kynurénine formamidase. Les données montrent que les ARNm de ces gènes sont présents dans les ailes nymphales à de faibles niveaux (par rapport à la référence ef1α) (Fig. S3), conformément aux données d'ARN-seq d'une étude précédente26 (Tableau S5).

Pour valider la fonction du vermillon et du cinabre dans les yeux et les ailes de B. anynana, nous avons perturbé la séquence codante des deux gènes à l'aide de CRISPR. Alors que les yeux WT apparaissent en noir (Fig. 1G), les adultes croquants vermillon avaient des yeux jaunes ou roses homogènes (n = 5) (Fig. 1H) et les adultes croquants cinabre (n = 6) présentaient une pigmentation plus claire dans les taches de mosaïque dans les yeux. (Fig. 1I). La plupart de ces individus présentant des phénotypes oculaires (n = 5 vermillon, n = 4 cinabre) (Figs. S4, S15) ont été confirmés pour les indels sur le site cible CRISPR en utilisant le séquençage illumina de l'ADN extrait du tissu oculaire (Figs. 1J,K , S5–S9, S16–S19).

Les crispants de vermillon (Figs. 4B – D, S4) et de cinabre (Figs. 5B – D, S15) n'ont produit aucun phénotype d'aile. Pour confirmer si le vermillon et le cinabre ont été éliminés avec succès dans l'aile, nous avons effectué un séquençage illumina sur les ailes de chaque individu présentant des phénotypes de pigmentation oculaire. Nous avons obtenu des indels sur les sites cibles CRISPR chez chaque individu testé (n = 5 vermillon, n = 6 cinabre) (Figs. 4E, S10–S14), (Figs. 5E, S20–S25).

Aucune fonction du vermillon détectée dans les ailes de Bicyclus anynana. Ailes WT adultes (A et B) et ailes croustillantes vermillon (B – D). Indels sur le site de (E) crispants vermillon des ailes respectives de (B – D). Aucun phénotype spécifique ou clone mosaïque n'a été observé dans les ailes adultes. Les perturbations génétiques au site cible ont été confirmées par séquençage illumina. La boîte rouge met en évidence le site cible CRISPR.

Aucune fonction du cinabre détectée dans les ailes de B. anynana. Ailes WT adultes (A) et ailes croquantes cinabre (B – D). Indels sur le site de (E) crispants de cinabre des ailes respectives du panneau BD. Aucun phénotype spécifique ou clone mosaïque n'a été observé dans les ailes adultes. Les perturbations génétiques au site cible ont été confirmées par séquençage illumina. La boîte rouge met en évidence le site cible CRISPR.

Nous avons testé un gène de biosynthèse ommochrome connu supplémentaire, la kynurénine formamidase (kfase), en utilisant HCR (Fig. S26) et CRISPR (Fig. S27). Dans ce cas, les knock-out de la kfase n'ont entraîné aucun phénotype observable d'œil ou d'aile (n = 5) (Fig. S27), même si les transcrits étaient clairement localisés dans les cellules ommatidiennes au cours du développement des pupes (Fig. S27; Tableau S5 ). Aucun mutant kfase connu n'a été signalé pour les espèces d'insectes1.

Comme nous n'avons pu identifier aucun défaut de pigmentation des ailes avec le vermillon et le cinabre, nous étions curieux de tester si des pigments ommochromes étaient en fait présents dans la région de l'écaille orange des ailes adultes de B. anynana. Nous avons extrait des pigments des écailles orange de B. anynana, ainsi que des pigments de la région orange de deux espèces de Junonia, car des études sur J. coenia ont précédemment confirmé des ommochromes dans leurs ailes5. Nous avons mené une expérience de chromatographie sur couche mince (CCM) avec deux pigments témoins avec des facteurs de rétention connus (Rf), l'amarante et le bleu de bromophénol, pour aider à identifier la présence d'ommochromes (également avec des Rf connus)17 (Fig. 6). Nous avons observé la présence d'un pigment avec la même valeur Rf chromatographique de la dihydro-xanthommatine chez B. anynana (flèche noire, Fig. 6A; Tableau 1). Chez J. almana, un pigment avec les propriétés de rétention de l'ommatin-D était présent à des niveaux plus élevés (flèche orange, Fig. 6C; Tableau 1), tandis que J. orythia indiquait la présence probable d'ommatin-D et de xanthommatine (orange et violet flèches, figure 6E ; tableau 1). Ces résultats montrent la présence d'ommochromes dans les ailes de B. anynana malgré l'absence de fonction d'enzymes biosynthétiques ommochromes connues dans le tissu alaire de cette espèce. Les pigments dans les bandes TLC, cependant, nécessitent une validation supplémentaire avec des expériences de spectrométrie de masse.

Chromatographie sur couche mince (CCM) sur les pigments extraits des sections orange de B. anynana, J. almana et J. orythia. (A, B) Pigments extraits de l'anneau orange de B. anynana montrant une bande à la valeur du facteur de rétention (Rf) de la dihydro-xanthommatine (flèche noire). (C,D) Pigments extraits de l'anneau orange de J. almana montrant une bande à la valeur Rf de l'ommatin-D (flèche orange). (E,F) Pigments extraits de l'anneau orange de J. orythia montrant une bande à la valeur Rf de la xanthommatine et de l'ommatin-D (flèche violette et orange). Les pigments témoins amarante et bleu de bromophénol migrent respectivement sous forme de pigments rouges et bleus (flèche rouge et bleue). Le bleu de bromophénol a deux bandes brunes et jaunes supplémentaires et l'amarante a une bande rouge supplémentaire. (G) Spectre UV-Visible de 77% (120 h) d'extrait de pigment d'hémolymphe pupal PD, montrant trois pics marqués par des lignes pointillées colorées à des longueurs d'onde correspondant probablement à la kynurénine (rouge, 366 nm), la xanthommatine (bleu, 440 nm) et dihydro -xanthommatine (vert, 470 nm).

Pour explorer davantage la façon dont les ommochromes sont présents dans les ailes de B. anynana, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle les ommochromes et leurs précurseurs pourraient être extraits de l'hémolymphe et incorporés dans les écailles des ailes pendant le développement des pupes. Nous avons purifié les pigments de l'hémolymphe d'individus à 77 % (120 h) PD et obtenu leurs spectres d'absorbance (Fig. 6G). Nous avons observé des pics d'absorbance à différentes longueurs d'onde de 366 nm, 440 nm et 470 nm. Sur la base des valeurs rapportées précédemment27,28,29, ces longueurs d'onde indiquent la présence probable de kynurénine, de xanthommatine et de dihydro-xanthommatine respectivement dans l'hémolymphe. Ces résultats indiquent que l'un des mécanismes par lesquels les ommochromes apparaissent dans les ailes de B. anynana pourrait être via le transport depuis l'hémolymphe.

Chez B. anynana , les enzymes ommochromes vermillon et cinabre sont exprimées dans les cellules pigmentaires des ommatidies pendant le développement pupal où elles fonctionnent dans la synthèse des pigments. Les deux gènes sont transcrits à environ 77% PD (120 h) dans les yeux (Fig. 1A – F) avec des transcrits détectés dès 31% PD (48 h) et 46% PD (72 h) (Fig. S1D, E ). Dans chaque ommatidium, l'expression était limitée à la périphérie, où se situent les cellules pigmentaires primaires et secondaires1 (Fig. 1A–F). La plupart des crispants vermillon avaient une couleur homogène des yeux orange pâle (Fig. 1H), tandis que les crispants cinabre avaient pour la plupart des taches rouges plus claires dans les yeux (Fig. 1I). Ces résultats sont similaires aux études d'expression chez d'autres espèces d'insectes telles que Acheta domesticus et Henosepilachna vigintioctopunctata30,31, et aux études d'inactivation du vermillon ou du cinabre chez Tribolium castaneum, Aedes aegypti, Plutella xylostella, Nasonia vitripennis et Helicoverpa zea, qui ont tous modifié les ommatidies adultes. coloration9,10,12,15,32.

Ni le vermillon ni le cinabre ne jouent un rôle fonctionnel dans la synthèse des ommochromes des ailes chez B. anynana, malgré la présence d'ARNm codant à la fois pour les enzymes des ailes des pupes et la présence probable d'ommochromes sur l'aile adulte. Dans nos expériences, aucune expression notable de ces gènes n'était apparente dans les ailes et les taches oculaires des larves et des pupes avant 92% de PD (144 h) (Figs. 2, 3). La validation fonctionnelle de ces deux enzymes ommochromes à l'aide de CRISPR-Cas9 n'a pas non plus abouti à un phénotype observable dans les ailes de B. anynana (Figs. 4, 5, S4, S15), malgré la présence d'un grand pourcentage de lectures avec des indels suggérant KO réussis dans la majorité des cellules des ailes (Figs. 4, 5, S10–S14, S20–S25). Le manque d'expression forte du vermillon et du cinabre à travers l'aile et l'absence de phénotypes CRISPR, malgré la confirmation des perturbations génétiques de ces gènes dans chaque aile de crispants oculaires réussis, suggèrent que ces gènes ne jouent pas un rôle dans la synthèse de l'ommochrome dans le ailes de B. anynana. Que ces gènes jouent ou non un rôle dans la synthèse locale des ommochromes dans les ailes d'autres espèces, telles que Heliconius erato, Vanessa cardui et Junonia coenia17,18,20, attend également des tests fonctionnels directs avec les deux gènes.

La présence de gènes de synthèse d'ommochromes fonctionnellement redondants devra être explorée plus avant chez B. anynana. Une telle redondance fonctionnelle pourrait expliquer le manque de phénotypes dans les ailes, où le rôle du vermillon et du cinabre pourrait être repris par d'autres gènes. L'absence d'expression claire de kfase dans les ailes WT et de phénotypes mutants pour les crispants kfase suggère que ce gène pourrait également ne pas fonctionner dans la synthèse d'ommochrome sur les ailes de B. anynana. Dans ces crispants, cependant, nous n'avons pas confirmé la présence d'indels. De plus, la fonction d'autres enzymes de voie telles que le cardinal n'a pas encore été étudiée chez B. anynana.

Ici, nous avons montré que les pigments ommochromes font probablement partie de l'anneau orange des ailes de B. anynana. Il a été proposé que les ommochromes soient impliqués dans la coloration de l'anneau orange des taches oculaires chez cette espèce en se basant uniquement sur l'expression et les données fonctionnelles d'optix21, un régulateur en amont des ommochromes chez d'autres papillons20. En utilisant la chromatographie sur couche mince, cependant, nous avons identifié une petite quantité d'un pigment, dans la région de l'échelle orange des taches oculaires, qui correspond (en valeur Rf) à l'ommochrome dihydro-xanthommatine. L'identité de ces ommochromes est également probablement distincte des pigments ommochromes présents dans les ailes de Junonia. Ces ommochromes, cependant, ne semblent pas être déposés dans les écailles des ailes dans les granules de pigment visibles, comme observé via SEM33 (Fig. S28), comme décrit pour les cellules pigmentaires ommatidiennes dans les yeux d'insectes34. L'identité moléculaire précise des pigments observés à l'aide de TLC, cependant, devra être confirmée davantage à l'aide de la spectrométrie de masse.

Chez B. anynana, l'ommochrome et/ou les précurseurs d'ommochrome trouvés sur les ailes peuvent être synthétisés dans un autre organe, transportés via l'hémolymphe et être captés via des transporteurs d'ommochrome dans les écailles orange (Fig. 7). Un mécanisme de transport similaire a été émis l'hypothèse pour le précurseur 3-hydroxykynurine dans les ailes des papillons Heliconius18. Les premières études ont démontré que les métabolites de la biosynthèse des ommochromes peuvent être sécrétés d'un tissu dans l'hémolymphe et traités par un autre type de tissu. Chez les larves d'Ephestia kühniella, l'activité de la kynurénine 3-hydroxylase (cinabre) était uniquement localisée dans les tubes de Malpighi, tandis que son produit enzymatique, la 3-hydroxykynurénine, était détecté dans l'hémolymphe larvaire, ainsi que des métabolites antérieurs de la voie pigmentaire, tels que le tryptophane et la kynurénine35 (Fig. . 7). Les ommatidies nymphales de cette espèce sont capables d'absorber la 3-hydroxykynurénine transmise par l'hémolymphe pour produire des ommochromes lorsque le métabolite est injecté dans l'hémolymphe36. Chez les pupes du papillon Araschnia levana, une augmentation de la 3-hydroxykynurénine a été trouvée dans l'hémolymphe lorsque des pigments rouges sont apparus dans les écailles des ailes, et l'injection de 3-hydroxykynurénine radiomarquée a révélé que son incorporation dans l'aile coïncidait avec la localisation spatiale des écailles rouges37. Chez Papilio xuthus, la kynurénine circule librement dans l'hémolymphe pendant le développement des nymphes et augmente en concentration lorsque la formation d'ommochromes ommatidiens s'initie, et diminue fortement lorsqu'une couleur rouge des ailes apparaît38. Ces études suggèrent que les ommochromes trouvés dans les ailes (et les yeux) de ces espèces divergentes de papillons nocturnes et de papillons pourraient provenir de l'hémolymphe.

Mécanisme de biosynthèse et/ou d'absorption des ommochromes dans les cellules pigmentaires des ommatidies et les cellules à écailles d'orange des papillons Bicyclus anynana. Dans les cellules pigmentaires des ommatidies, le tryptophane est absorbé par le transporteur de karmoisine proposé où, en présence des enzymes Vermillon, Kfase et Cinabre, il est converti en 3-hydroxykynurénine (3-OHK). Le 3-OHK est absorbé à l'intérieur du granule de pigment par les protéines de transport White et Scarlet où il est converti en xanthommatine et dihydro-xanthommatine. Dans les écailles d'orange, soit le tryptophane est converti en 3-OHK, par un mécanisme inconnu, soit il est transporté de l'hémolymphe via des transporteurs inconnus vers les cellules de l'écaille où il est converti en xanthommatine et dihydro-xanthommatine. Nous proposons également l'absence de granules de pigment pour les ommochromes dans les cellules de l'échelle. Notez qu'il n'y a aucune preuve directe concernant l'implication de la karmoisine dans l'absorption du tryptophane chez la drosophile.

Un mécanisme alternatif pour expliquer la présence d'ommochromes dans les ailes dépourvues de l'expression du vermillon et du cinabre pourrait impliquer l'utilisation d'enzymes distinctes dans les ailes et les yeux (Fig. 7). Chez Vanessa cardui, des analyses d'expression génique différentielle effectuées sur différentes régions colorées de l'aile ont identifié 26 gènes potentiellement impliqués dans la pigmentation ommochrome. Ces gènes comprennent optix, kfase, cinabre, sept transporteurs majeurs de la superfamille des facilitateurs (MFS), deux protéines juvéniles de liaison aux hormones et deux transporteurs non classés39. Notamment, les gènes de transporteur ommochrome blancs et écarlates ne se sont pas avérés exprimés de manière différentielle entre les points de temps testés et les zones de couleurs différentes des ailes de V. cardui. Chez Heliconius, l'expression de trois nouveaux gènes transporteurs a également été associée à des motifs d'ailes rouges40. Chez B. anynana, les knock-outs CRISPR des transporteurs ommochromes blancs et écarlates n'ont pas non plus conduit à un phénotype visible sur les ailes23, suggérant la possibilité de nouvelles enzymes ainsi que des transporteurs ommochromes présents dans les cellules squameuses de toutes ces espèces. Ainsi, il est possible qu'au cours de l'évolution, des enzymes et des protéines de transport distinctes aient été déployées dans les ailes de B. anynana, par rapport à celles utilisées dans les yeux.

En conclusion, nous avons montré l'implication des enzymes de biosynthèse des ommochromes vermillon et cinabre dans la production locale de pigments dans les yeux mais pas dans les ailes des papillons Bicyclus anynana. Ces enzymes pourraient encore être impliquées dans la production des pigments ommochromes qui finissent par se déposer dans les zones orange des ailes, mais elles ne semblent pas être fonctionnelles dans les cellules des ailes elles-mêmes. Les pigments ommochromes ou précurseurs de pigments sont soit transportés dans les cellules de la cochenille, après les deux étapes enzymatiques étudiées, soit synthétisés in situ via de nouvelles enzymes.

HCR3.0 a été réalisé sur la base des protocoles précédemment décrits24. En bref, les tissus des ailes et des yeux composés aux moments souhaités après la nymphose ont été disséqués dans une solution de PBS 1X à température ambiante et fixés dans des puits de verre contenant 4% de formaldéhyde dans du PBS 1X. Après 30 à 40 min de fixation à température ambiante, les tissus ont été lavés deux fois dans du PBS 1X pendant 3 min puis deux fois dans du PBS 1X additionné de 0,1% de Tween 20 (PBST 1X). La perméabilisation a été réalisée en incubant les tissus pendant 30 min dans une solution détergente contenant 1, 0% de SDS, 0, 5% de Tween 20, Tris – HCl (pH 7, 5), 1, 0 mM EDTA (pH 8, 0) et 150, 0 mM NaCl. Les ailes de pupes à un stade avancé (> 60 % de développement des nymphes) avec des cuticules plus épaisses ont été digérées dans 2,5 μL de protéinase K dans 200 μL de PBST 1X pendant 2 min à 55 °C afin d'améliorer la perméabilité des tissus pour l'entrée de la sonde. Par la suite, les ailes ont été placées sur de la glace et le mélange de digestion a été remplacé par 2 mg/mL de glycine dans du PBST 1X a été ajouté pour arrêter la réaction. Les tissus ont ensuite été lavés trois fois avec du PBST 1X et deux fois avec du SSCT 5X. Les tissus ont été incubés dans un tampon d'hybridation de sonde à 30 % à 37 °C pendant 30 min, avant une incubation plus longue dans un tampon d'hybridation de sonde à 30 % avec des sondes primaires de 0,02 μM (spécifiques au vermillon, au cinabre et à la kfase) à 37 °C pendant 16 h. . Les tissus ont été lavés quatre fois dans un tampon de lavage de sonde à 30 % à des intervalles de 15 minutes à 37 °C et lavés deux fois avec 5X SSCT à température ambiante. Les tissus ont été incubés dans un tampon d'amplification pendant 30 min à température ambiante puis dans un tampon d'amplification avec des sondes fluorescentes secondaires dans l'obscurité à température ambiante pendant 12 h. Les tissus ont ensuite été lavés dans du SSCT 5X quatre fois à des intervalles de 20 minutes, incubés avec du DAPI dilué dans du SSCT 5X pendant 5 minutes et lavés deux fois avec du SSCT 5X. Les tissus ont été montés sur une lame de verre dans un tampon de montage et imagés avec un microscope confocal Olympus FV3000.

L'édition de gènes CRISPR-Cas9 pour le vermillon, le cinabre et la kynurénine formamidase a été effectuée conformément au protocole décrit précédemment41 avec les ajustements mineurs suivants. Pour tous les gènes, des ARN guides synthétiques (ARNcr) ont été conçus (séquences dans le fichier supplémentaire) à l'aide de l'outil de conception de guides personnalisés IDT. Une solution comprenant un tampon duplex, un tampon Cas9 et des mélanges équimolaires de crARN et de tracrARN Alt-R® CRISPR-Cas9 a été incubée à 95 ° C pendant 5 min et refroidie à température ambiante avant l'ajout de la nucléase Cas9.

Nous avons confirmé la présence de mutations vermillon et cinabre à la fois dans les tissus pupes et adultes. Les tissus des ailes des pupes ont été disséqués des individus soit à 25 à 28% (40–44 h) soit à 44 à 47% (70–74 h) du développement pupal. L'ADN a été extrait et purifié à l'aide du kit d'ADN tissulaire Omega Bio-tek EZNA (SKU : D3396-01). Dans les crispants adultes, les tissus des yeux et des ailes ont été isolés et les deux types de tissus ont été traités séparément en utilisant les techniques d'extraction d'ADN comme mentionné ci-dessus. Le séquençage apparié a été effectué sur des bibliothèques de séquençage comprenant la région d'intérêt amplifiée et la présence d'INDEL a été vérifiée avec Geneious v10.1.3.

L'extraction des pigments des sections d'ailes a été réalisée selon un protocole préalablement défini5,17. Les régions d'écailles orange des ailes ont été isolées de l'aile adulte de B. anynana, J. almana et J. orythia à l'aide de ciseaux fins (Fig. 6). Les tissus d'ailes disséqués ont été homogénéisés dans du méthanol acidifié (HCl à 0,5 %) en utilisant des billes de zirconium de 0,01 mm dans un homogénéisateur (Next Advance Bullet Blender). L'homogénat a été centrifugé à 14 000 tr/min pendant 5 minutes et le surnageant a été desséché dans une centrifugeuse sous vide (ThermoScientific) pendant 30 minutes et reconstitué dans 20 ul de méthanol. Les mélanges de pigments, ainsi que les colorants de référence amarante et bleu de bromophénol, ont été déposés sur une plaque de gel de silice (F254, Merck) et traités avec du phénol (SigmaAldrich) comme solvant de développement. Les valeurs du facteur de rétention (Rf) ont été calculées comme le rapport de la distance de migration du composé pigmentaire à celle du front de solvant mesuré sur ImageJ.

Lors de l'élevage à 61,5% de développement pupal, l'hémolymphe pupale a été extraite d'individus B. anynana de type sauvage. Les pigments ommochromes ont été extraits de l'hémolymphe nymphale à l'aide de méthanol froid selon un protocole préalablement défini18, et dilués dans du méthanol absolu. Des échantillons de pigment d'hémolymphe ont été transférés dans des cuvettes de 1,5 ml et les spectres d'absorbance ont été acquis à l'aide d'un spectrophotomètre à balayage UV/Visible Shimadzu UV-1800. Les données spectrales ont été analysées à l'aide du logiciel Shimadzu UVProbe et R.

Les adultes ont été congelés pendant une journée à − 20 °C. Les ailes de papillon ont été retirées à l'aide d'une paire de ciseaux fins et imagées sous un microscope Leica DMS1000. Pour l'imagerie des yeux adultes, les adultes ont été congelés pendant 40 min à - 20 ° C afin de minimiser l'étendue des changements de couleur des yeux composés post-mortem avant l'imagerie.

Le tissu d'aile de pupe a été disséqué à partir d'individus de type sauvage 15 % PD (24 h) et stocké dans la solution de stabilisation Invitrogen™ RNAlater™. L'ARN total a été extrait et purifié à l'aide du kit Qiagen RNeasy Plus Micro (Cat No. 74034). L'ADN complémentaire a été synthétisé à l'aide de la transcriptase inverse Invitrogen™ SuperScript™ II (n° de catalogue 18064014) et dilué à 50 ng/μL. La PCR a été réalisée sur l'ADNc en utilisant des amorces spécifiques des gènes d'intérêt et du gène de référence ef1α (Tableau S4) en utilisant 2× PCRBIO Taq Mix Red (Cat. n° : PB10.11-20) pendant 32 cycles. Les produits de PCR ont été exécutés sur un gel d'agarose à 1 % et imagés sous un système de documentation sur gel (Azure 200 Gel Imaging System : AZI200).

Une fine aiguille en métal a été utilisée pour prélever des écailles sur les ailes des WT adultes. Les écailles ont ensuite été montées sur une bande de carbone fixée à un talon SEM, revêtue de platine à l'aide de JEOL JFC-1600 Auto Fine Coater et imagées sous un SEM à émission de champ JEOL JSM-6701F.

Les ensembles de données analysés dans la présente étude sont disponibles dans le référentiel NCBI. Toutes les séquences utilisées ainsi que leurs identifiants de gènes et leur lien direct sont mentionnés dans le fichier complémentaire.

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Nous tenons à remercier CBIS, NUS pour l'accès au microscope confocal fv3000, le professeur agrégé Leong Weng Kee et Teresa Lim pour leur aide et l'accès au spectrophotomètre UV-Visible, Lee Ka Yau (installation SEM, Département de chimie, NUS) pour son aide pour l'imagerie des échantillons SEM, et Suriya Narayanan Murugesan pour avoir fourni des papillons adultes Junonia almana et Junonia coenia. Nous tenons également à remercier le professeur Robert D. Reed pour sa perspicacité inestimable dans l'interprétation de nos résultats.

Ce travail a été soutenu par une fondation nationale de recherche (NRF) de Singapour, dans le cadre de son programme de recherche (prix NRF-NRFI05-2019-0006) et du programme de recherche compétitive NRF (prix NRF-CRP20-2017-0001).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : How Hong Chuen Shaun et Tirtha Das Banerjee.

Département des sciences biologiques, Université nationale de Singapour, Singapour, 117557, Singapour

Comment Hong Chuen Shaun, Tirtha Das Banerjee et Antόnia Monteiro

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Rédaction—ébauche originale : HHCS, TDB ; Rédaction—révision et édition : HHCS, TDB, AM ; Conceptualisation : TDB, AM ; Méthodologie et enquête : HHCS, TDB ; Validation : HHCS, TDB ; Analyse formelle : HHCS, TDB ; Ressources : AM ; Conservation des données : HHCS, TDB ; Visualisation : HHCS, TDB ; Supervision : TDB, AM ; Administration du projet : AM ; Acquisition de financement : AM

Correspondance à Tirtha Das Banerjee ou Antόnia Monteiro.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Shaun, HHC, Banerjee, TD & Monteiro, A. Le vermillon et le cinabre sont impliqués dans la biosynthèse des pigments ommochromes dans les yeux mais pas dans les ailes des papillons Bicyclus anynana. Sci Rep 13, 9368 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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Reçu : 13 février 2023

Accepté : 05 juin 2023

Publié: 09 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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