Signatures du microbiome intestinal de l'adaptation à l'environnement extrême chez le porc tibétain

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 27 (2023) Citer cet article

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Les porcs tibétains (TP) peuvent s'adapter aux environnements extrêmes du plateau tibétain impliqués par leurs signaux d'auto-génome, mais on sait peu de choses sur les rôles du microbiote intestinal dans l'adaptation à l'hôte. Ici, nous avons reconstruit 8210 génomes assemblés par métagénome à partir de TP (n = 65) vivant dans des porcs captifs à haute et basse altitude (87 de Chine—CP et 200 d'Europe—EP) qui ont été regroupés en 1050 bacs génomiques au niveau de l'espèce. (SGB) au seuil de 95 % d'identité nucléotidique moyenne. 73,47% des SGB représentaient de nouvelles espèces. L'analyse de la structure de la communauté microbienne intestinale basée sur 1 048 SGB a montré que les TP étaient significativement différents des porcs captifs à basse altitude. Les SGB associés à la TP ont permis de digérer plusieurs polysaccharides complexes, notamment la cellulose, l'hémicellulose, la chitine et la pectine. En particulier, nous avons constaté que les TP présentaient l'enrichissement le plus courant des phylums Fibrobacterota et Elusimicrobia, qui étaient impliqués dans la production d'acides gras à chaîne courte et moyenne (acide acétique, butanoate et propanoate ; acides octanomique, décanoïque et dodécanoïque), ainsi que dans la biosynthèse du lactate, de 20 acides aminés essentiels, de multiples vitamines B (B1, B2, B3, B5, B7 et B9) et de cofacteurs. De manière inattendue, Fibrobacterota a uniquement montré une puissante capacité métabolique, notamment la synthèse d'acide acétique, d'alanine, d'histidine, d'arginine, de tryptophane, de sérine, de thréonine, de valine, de B2, de B5, de B9, d'hème et de tétrahydrofolate. Ces métabolites pourraient contribuer à l'adaptation de l'hôte à la haute altitude, comme la récupération d'énergie et la résistance à l'hypoxie et au rayonnement ultraviolet. Cette étude fournit des informations sur la compréhension du rôle du microbiome intestinal joué dans l'adaptation des mammifères à haute altitude et découvre certains microbes potentiels en tant que probiotiques pour améliorer la santé animale.

Le porc tibétain (Sus scrofa domesticus) est une race indigène originaire du plateau Qinghai-Tibet qui peut survivre dans des environnements difficiles à haute altitude à long terme, tels que l'hypoxie, le froid intense, le rayonnement ultraviolet intense (UV) et la pénurie alimentaire1, 2,3. Par conséquent, la compréhension du mécanisme d'adaptation à haute altitude du porc tibétain est très importante pour la découverte de nouveaux composants génétiques impliqués dans la résistance au stress. L'analyse génomique a découvert 268 gènes sous sélection positive chez les sangliers tibétains qui sont liés à des adaptations à haute altitude, telles que le maintien de la stabilité génomique contre les rayons UV et l'adaptation moléculaire sous hypoxie4. Plus précisément, cette étude a identifié trois gènes de liaison à la vitamine B6 (ALB, SPTLC2 et GLDC) qui aident à la synthèse de l'hémoglobine et améliorent la liaison à l'oxygène et quatre gènes liés à l'hypoxie (ALB, ECE1, GNG2 et PIK3C2G). Une étude plus approfondie a révélé des mutations génétiques dans les gènes PLA2G12A et EPAS1 liées à la variation phénotypique du tonus vasculaire pulmonaire et de la concentration d'hémoglobine5. Récemment, des études supplémentaires ont également prêté attention aux signatures du microbiome intestinal de l'adaptation à haute altitude chez le porc tibétain, en raison du rôle essentiel joué par le microbiote intestinal dans le métabolisme nutritionnel6,7, la régulation énergétique8,9 et le développement du système immunitaire pour maintenir la santé de l'hôte10,11. Par exemple, une méta-analyse ribosomique 16 S a révélé les trois bactéries intestinales les plus abondantes Acinetobacter, Pseudomonas et Sphingobacterium chez le porc tibétain par rapport au porc de basse altitude12. L'analyse métabolomique de 12 échantillons fécaux de porc tibétain de haute altitude a démontré que les productions d'acide propanoïque et d'acide octadécanoïque étaient significativement améliorées et que les gènes liés à ces deux métabolites étaient également régulés à la hausse12. En bref, ces découvertes ont indiqué que les environnements de haute altitude ont façonné le microbiome intestinal unique et la diversité fonctionnelle du porc tibétain. Cependant, la diversité et le paysage fonctionnel du microbiote intestinal chez le porc tibétain et sa signature pour l'adaptation de l'hôte à haute altitude ne sont pas clairs, en raison des limites de la petite taille de l'échantillon et de la faible profondeur de séquençage métagénomique dans les études précédentes.

Les porcs sont les principaux animaux domestiques dans le monde et constituent une composante importante de la production animale mondiale. Cependant, la croissance rapide de la production animale au cours des dernières décennies a également entraîné l'émergence et la propagation de maladies infectieuses, telles que le virus de la diarrhée épidémique porcine, et entraîne directement d'énormes pertes économiques pour l'industrie porcine13,14. Il est à l'origine des applications les plus courantes de l'administration d'antibiotiques dans la production porcine pour le traitement et la prévention des infections pendant les périodes d'allaitement et de post-sevrage. L'utilisation d'antibiotiques contribue à l'augmentation de la résistance microbienne et à la diminution de la diversité microbienne15,16, de même qu'elle peut présenter un risque pour la santé des porcs. Pour réduire l'effet secondaire de l'utilisation d'antibiotiques, Blaser17 a recommandé des probiotiques pour remplacer les espèces et souches vitales manquantes et/ou éteintes qui modulaient les voies de développement cruciales, peut-être avec des prébiotiques d'accompagnement. Les parents sauvages ou les races indigènes d'animaux domestiques pourraient représenter une énorme ressource pour l'exploration des probiotiques. Par exemple, Rosshart et al.18 ont rapporté que la greffe éventuelle de microbiome intestinal de souris sauvage dans des souris de laboratoire pourrait favoriser la forme physique de l'hôte et améliorer la résistance aux maladies de l'infection pulmonaire et de la tumorigenèse. Le transfert de microbes fécaux d'une race de porc indigène qui avait une plus grande résistance aux maladies dans les porcelets commerciaux pourrait prévenir la diarrhée récurrente induite par le stress du sevrage précoce19. Récemment, plus de 13 000 gènes dégradant les glucides ont été identifiés dans le microbiome intestinal du porc tibétain (n = 11), qui étaient principalement répartis en cinq phyla : Firmicutes, Bacteroidetes, Spirochaetota, Verrucomicrobiota et Fibrobacterota20. Ces études ont indiqué que le porc tibétain pourrait héberger des microbes probiotiques inattendus pour l'amélioration de la santé des porcs. Cependant, jusqu'à présent, une enquête systémique au niveau du génome sur le microbiome intestinal du porc tibétain fait toujours défaut.

Ici, nous avons effectué un séquençage métagénomique profond de 31 échantillons de contenu fécal et 34 de caecum provenant de 47 porcs tibétains (TP) broutant librement situés dans la préfecture de Deqen de la province du Yunnan en Chine, à une altitude moyenne de plus de 3500 m au-dessus du niveau de la mer. Nous avons récupéré 1048 bacs génomiques au niveau de l'espèce (SGB) à partir du microbiome intestinal du porc en intégrant les métagénomes intestinaux publiés de 287 porcs captifs à basse altitude (87 de Chine -PC et 200 d'Europe -EP). Nous avons découvert une diversité et des profils fonctionnels distincts du microbiote intestinal dans les TP par rapport aux CP et aux EP. Les résultats fourniront non seulement des informations sur la compréhension de l'adaptation à haute altitude des porcs tibétains, mais exploreront également le potentiel du microbiote intestinal associé aux TP en tant que probiotiques.

Plus de 779 Gb de données de séquence métagénomique ont été générées par la plateforme Illumina HiSeq × Ten à partir de 65 échantillons de TP (tableau supplémentaire 1). Nous avons intégré les lectures brutes de séquençage ci-dessus avec un ensemble de données de séquence métagénomique publié de 287 porcs captifs du Danemark, de France et de Chine21 pour générer le catalogue du génome intestinal des porcs. En utilisant une stratégie d'assemblage à échantillon unique, nous avons reconstruit un total de 8210 MAG avec un seuil de qualité d'exhaustivité> 75% et une contamination <10% 22,23 (voir «Méthodes»; Fig. 1A). Au total, 3807 de ces MAG étaient des génomes de haute qualité avec> 90% d'exhaustivité avec <5% de contamination (Fig. 1B). Après déréplication à un seuil moyen d'identité nucléotidique (ANI) de 95%24, 1050 SGB ont été identifiés pour une analyse plus approfondie (voir "Méthodes"). Nous avons utilisé au moins 40 % de couverture génomique pour déterminer la présence de SGB dans chaque échantillon, et 1 048 SGB représentatifs ont finalement été obtenus, dont 623 SGB (59,45 %) étaient des génomes de haute qualité (> 90 % d'exhaustivité et < 5 % de contamination) (Tableau supplémentaire 2). Chaque SGB était soutenu par une moyenne de 7,8 MAG et 57,25% des SGB contenaient au moins deux MAG (tableau supplémentaire 2). Nous avons utilisé la boîte à outils de la base de données de taxonomie du génome (GTDB-Tk)25 pour effectuer l'attribution taxonomique des SGB (voir "Méthodes)". Les résultats ont montré qu'ils étaient classés en 20 phylums bactériens et un phylum d'archaea, 90, 74% des SGB ont été attribués à des genres connus et 73, 47% des SGB étaient des espèces non classées (nommées uSGB) (Fig. 1C). En outre, 45,04% des 1048 SGB ont été attribués à Firmicutes A, 25,86% à Bacteroidetes, 6,97% à Firmicutes et 5,63% à Proteobacteria (tableau supplémentaire 3). La prévalence et la classification des SGB dans les TP, les EP et les CP ont été présentées à la Fig. 1D, indiquant les différences de communauté microbienne au niveau du phylum entre trois groupes. De plus, les profils de gènes fonctionnels de 1048 SGB ont été prédits à l'aide de MetaGeneMark (v.3.38)26 (voir "Méthodes"). Toutes les annotations de gènes ont été effectuées en utilisant les bases de données d'enzymes actives glucidiques (CAZymes)27 et de l'encyclopédie Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) Orthology (KO)28 (voir "Méthodes").

A Profils de moyenne et haute qualité des MAG. Taille du génome, N50 et nombre de contigs de génomes de qualité moyenne et élevée avec différentes couleurs indiquant une qualité de génome différente. Les données source associées sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. B Complétude et contamination estimées de 8210 génomes récupérés à partir de métagénomes d'intestin de porc. La qualité du génome a été notée comme complétude - 5 contaminations, et seuls les génomes avec un score de qualité supérieur à 75 % ont été retenus. Les génomes de qualité moyenne sont représentés en vert et les génomes de haute qualité en rouge. Histogrammes le long des axes x et y montrant le pourcentage de génomes à différents niveaux d'exhaustivité et de contamination, respectivement. Les données source associées sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. C Nombre de SGB dans chaque rang taxonomique. Les SGB sans génomes de référence existants au niveau de l'espèce par GTDB-Tk ont été définis comme des SGB inconnus (uSGB), à la place, les SGB ayant au moins un génome de référence ont été considérés comme des SGB connus (kSGB). D Arbre phylogénétique des intestins de porc représentatifs des SGB. Le cercle intérieur est un arbre phylogénétique de 1048 SGB représentatifs colorés selon les classifications taxonomiques au niveau de l'embranchement GTDB (voir la légende des couleurs). Anneaux concentriques se déplaçant vers l'extérieur du premier au troisième anneau représentant les SGB enrichis en groupe en fonction de la présence/absence de SGB dans chaque groupe. Les TP représentent les porcs tibétains qui paissent librement, les EP représentent les porcs européens captifs à basse altitude et les CP représentent les porcs chinois captifs à basse altitude. Les données source associées sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Chen et al.29 ont identifié 6339 MAG (> 50 % d'exhaustivité et < 5 % de contamination) et 2 673 SGB (ANI ≥ 95 %) à partir d'un ensemble de données sur le microbiome intestinal de 500 porcs chinois. Pour explorer le caractère unique de nos SGB identifiés, nous avons intégré nos 8210 MAG à l'ensemble de données de Chen et avons conservé les MAG avec une complétude > 75 % et une contamination < 5 % pour l'identification des SGB au seuil d'ANI ≥ 95 %. Au total, 2266 SGB ont finalement été obtenus. 1248 (55,08%) d'entre eux étaient uniques à l'étude de Chen, 519 (22,90%) à cette étude et 499 (22,02%) se chevauchaient (Fig. 1 supplémentaire). Cette découverte indique que des efforts continus sont nécessaires pour comprendre la diversité microbienne de l'intestin du porc.

Les analyses de diversité alpha et bêta du microbiote intestinal de quatre groupes (TP, CP, EP-Danemark, EP-France) ont été réalisées en fonction de la prévalence ou de l'abondance des SGB (voir "Méthodes"). Les résultats ont démontré que les indices de richesse en espèces, de Shannon et de diversité de Simpson étaient significativement augmentés dans les TP par rapport aux autres groupes (Fig. 2A, test de somme des rangs de Wilcoxon, p <0, 001). L'analyse des coordonnées principales (PCoA) (basée sur la matrice de distance pondérée UniFrac) et l'analyse de tracé multidimensionnelle non métrique (NMDS) (basée sur la matrice de distance Jaccard) ont systématiquement indiqué une séparation claire des TP des autres groupes (Fig. 2B, Fig. 2A, B supplémentaires). De plus, la différence de diversité microbienne entre les types d'échantillons (fécaux et caecum) était significativement plus faible que celle entre les groupes d'hôtes (Fig. 2C – F supplémentaires), ce qui suggère que les TP hébergent un microbiote intestinal distinct. Par exemple, 14,12 %, 8,97 % et 1,43 % de tous les SGB étaient présents uniquement dans les TP, les EP et les CP, respectivement (Fig. 2C). Selon la présence ou l'absence de chaque SGB dans chaque échantillon, nous avons constaté que 464 SGB étaient significativement associés aux TP, 209 SGB aux EP et 146 SGB aux CP (tableau supplémentaire 4, test de somme des rangs de Wilcoxon, p <0, 05, FDR corrigée). Au niveau du phylum, la prévalence de Fibrobacterota et d'Elusimicrobia était significativement plus élevée dans les TP que dans les EP et les CP (Fig. 2D; Fig. 2E, test de Fisher, p <0, 001). Au lieu de cela, Methanobacteriota connu pour son rôle dans la méthanogénèse30 était extrêmement significativement moins élevé dans les TP que dans les autres groupes (test de Fisher, p < 0,001). Les PC avaient la prévalence la plus élevée de Methanobacteriota (test de Fisher, p < 0,001). Les TP et les CP avaient une prévalence plus élevée d'Actinobacteriota et de Verrucomicrobiota que les EP (test de Fisher, p < 0,01). Les Desulfobacterota et Planctomycetotah existaient principalement dans les CP (test de Fisher, p < 0,001), et les Deferribacterota et Verrucomicrobiota_A étaient largement présents dans les EP (test de Fisher, p < 0,05).

Une comparaison des indices de diversité alpha du microbiome intestinal parmi les TP, les EP et les CP. Le graphique en violon et le diagramme en boîte représentant la richesse en espèces, l'indice de diversité de Shannon et Simpson, respectivement. Diagramme à barres de richesse en espèces basé sur la présence ou l'absence de SGB dans chaque échantillon, indice de diversité de Shannon et Simpson basé sur l'abondance relative de SGB dans chaque échantillon. Les couleurs indiquent les groupes d'hôtes. Les données source associées sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. B Comparaison de la diversité bêta entre les TP, les EP et les CP. La PCoA était basée sur la matrice de distance UniFrac pondérée entre les échantillons. Les couleurs et les formes indiquent respectivement les groupes d'hôtes et les types d'échantillons. Tracé PCoA montrant la communauté microbienne des TP séparée de celles des EP et des CP (analyse de variance multivariée par mutation, p = 0, 001, R2 ajusté = 0, 44). L'analyse de tracé B NMDS était basée sur la matrice de distance de Jaccard entre les échantillons. Les couleurs et les formes indiquent respectivement les groupes d'hôtes et les types d'échantillons. Le tracé NMDS démontre la communauté microbienne des TP séparés des EP et des CP (stress = 0,13). Les données source associées sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. C Répartition des SGB entre les TP, les EP et les CP. Diagramme de Venn montrant la prévalence des SGB dans les TP, les EP et les CP. Les couleurs indiquent le groupe d'échantillons. D Répartition du microbiote au niveau du phylum parmi les TP, les EP et les CP. Diagramme à secteurs montrant la prévalence des embranchements dans les TP, les EP et les CP. E, Comparaison de l'analyse d'enrichissement au niveau de l'embranchement entre les TP, les EP et les CP. Couleur et taille du graphique à bulles correspondant à la prévalence des SGB dans un certain phylum. La carte thermique montre le niveau de signification de l'enrichissement (pas de * représentant p > 0,05) et les couleurs indiquent les groupes enrichis.

Pour étudier le potentiel d'utilisation des glucides des SGB associés aux groupes hôtes, nous avons effectué une annotation CAZyme à l'aide de dbCAN231 et effectué une analyse d'enrichissement des CAZymes via le test de Fisher (voir "Méthodes"). Les résultats ont démontré que les SGB associés aux TP encodaient beaucoup plus de gènes d'utilisation des glucides que les SGB associés aux porcs captifs, et que les gènes appartenaient principalement aux familles des glycosides hydrolases (GH), aux familles des glucides estérases (CE) et aux familles des polysaccharides lyases (PL) (tableau supplémentaire 5 et Fig. 3, test de Fisher, p < 0,05). Par exemple, les SGB associés aux TP comprenaient plus de gènes dans GH43, CE12, GH105, GH88, GH35 et GH51 que les CP et les EP (test de Fisher, p <0, 001). Ils comprenaient également plus de gènes dans CE1, PL1 et GH53 que dans les CP, et de gènes dans GH127 et GH146 que dans les EP, respectivement (test de Fisher, p < 0,05). Sur la base de la base de données CAZy et dbCAN-PUL, nous avons constaté que tous les CAZymes de GH43, CE12, GH105, GH35 et GH51 étaient associés à la dégradation des polysaccharides végétaux, tels que la cellulose, la pectine, la chitine, le xylane et d'autres glucanes. Le GH88 est lié à l'utilisation du N-glycane et du glycosaminoglycane. CE1, PL1, GH53, GH127 et GH146 sont impliqués dans la dégradation de plusieurs polysaccharides, tels que la cellulose, les hémicelluloses et autres bêta-glucanes. Ces résultats suggèrent que le microbiome intestinal des TP a une capacité d'utilisation des polysaccharides significativement plus forte que les porcs en captivité.

Carte thermique montrant la différence significative dans les CAZymes (à l'exception des glycosyltransférases) entre les TP, les EP et les CP, et leurs substrats potentiels associés. Il ne démontre que les CAZymes considérablement enrichis dans l'ancien groupe d'hôtes.

Les Fibrobacterota et Elusimicrobia existaient principalement dans les TP plutôt que dans d'autres groupes (test de Fisher, p < 0,001). Notamment, les SGB des deux phylums bactériens étaient tous de haute qualité avec une complétude > 90 % et une contamination < 5 % (tableau supplémentaire 2). Par conséquent, nous avons effectué une annotation KO et une analyse d'enrichissement des voies KEGG pour déchiffrer leur potentiel fonctionnel. Les résultats ont montré qu'il y avait respectivement 38 voies KEGG enrichies de manière significative dans les SGB de Fibrobacterota et 39 voies dans les SGB d'Elusimicrobia (tableau supplémentaire 6, test de Fisher, p <0, 05, FDR corrigé). Dans l'ensemble, les deux phylums bactériens présentaient des caractéristiques métaboliques différentes, même si les dix voies les plus riches en eux comprenaient la traduction, la réplication et la réparation, la transduction du signal et le métabolisme énergétique (Fig. 4, test de Fisher, p <0, 001). Fibrobacterota était particulièrement impliqué dans le métabolisme des cofacteurs et des vitamines, ainsi que dans le métabolisme des acides aminés, et Elusimicrobia participait principalement à la biosynthèse et au métabolisme des glycanes, ainsi qu'au métabolisme des glucides. De plus, les voies enrichies impliquées dans le métabolisme des acides aminés étaient distinctes entre Fibrobacterota et Elusimicrobia (Fig. 4 et tableau supplémentaire 6, test de Fisher, p <0, 05, FDR corrigé). Par exemple, Fibrobacterota était significativement enrichi dans les voies de biosynthèse de la valine, de la leucine et de l'isoleucine (test de Fisher, p = 0,002), du métabolisme de l'alanine, de l'aspartate et du glutamate (test de Fisher, p = 0,010), de la biosynthèse de l'arginine (test de Fisher, p = 0,014 ), biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane (test de Fisher, p = 0,023), biosynthèse de la lysine (test de Fisher, p = 0,025), métabolisme de l'histidine (test de Fisher, p = 0,025), métabolisme de la cystéine et de la méthionine (test de Fisher, p = 0,032 ). Elusimicrobia a préféré la biosynthèse de la lysine (test de Fisher, p = 0,0174) et le métabolisme de la glycine, de la sérine et de la thréonine (test de Fisher, p = 0,0277).

Graphique à bulles montrant les voies KEGG considérablement enrichies chez Elusimicrobia et Fibrobacterota. La signification de l'enrichissement (valeur p) a été mesurée avec le test de Fisher (voir "Méthodes"). La couleur des bulles répond à l'importance de l'enrichissement et la taille des bulles est liée au rapport du nombre de gènes cartographiés sur une certaine voie. La même couleur des voies métaboliques à droite indique le même module de voie.

L'analyse des voies métaboliques a démontré que les SGB chez Fibrobacteres et Elusimicrobiota contenaient une série de gènes d'enzymes clés dans la voie de la glycolyse (10 gènes) et la voie du métabolisme du pyruvate (2 gènes) pour catalyser la conversion du glucose 6-phosphate en pyruvate et plus loin en court- acides gras à chaîne (SCFA), acides gras à chaîne moyenne (MCFA), lactate, éthanol, etc. (Fig. 5, Fig. 3 supplémentaire et tableau supplémentaire 7). De plus, ils codent de nombreux gènes d'enzymes pour la synthèse des acides gras, la conversion de l'acétyl-CoA en malonyl-CoA, ainsi que la synthèse de l'acide octanoïque, de l'acide décanoïque et de l'acide dodécanoïque. Néanmoins, les SGB chez Fibrobacteres ont codé plus de gènes enzymatiques dans ces voies que chez Elusimicrobiota, à l'exception des voies de synthèse du lactate, du butanoate, de l'éthanol et du propanoate. Il était remarquable que les SGB de deux phylums codent des gènes d'enzymes uniques pour participer à un certain processus catalytique. Par exemple, les SGB de Fibrobacteres étaient uniquement impliqués dans la synthèse de l'acide acétique par deux voies. L'un était la conversion du pyruvate directement en acide acétique. Un autre était le pyruvate en acétyl adénylate puis en acide acétique. Les SGB d'Elusimicrobiota étaient simplement impliqués dans la conversion directe du pyruvate en lactate. Certes, certaines voies pourraient nécessiter une inter-coopération des deux phylums, comme la synthèse du butanoate. Les enzymes clés trans-2-énoyl-CoA réductase [EC:1.3.1.44] et butyrate kinase [EC:2.7.2.7] ont été annotées à partir des SGB chez Fibrobacteres et chez Elusimicrobiota, respectivement.

Elusimicrobia et Fibrobacterota étaient impliqués dans la dégradation des polysaccharides, le transport membranaire, la glycolyse et le cycle TCA, ainsi que l'anabolisme des acides gras, des acides aminés, des vitamines B et des cofacteurs. DHAP dihydroxyacétone phosphate, GAP glycéraldéhyde 3-phosphate, PRPP 5-phosphoribosyl diphosphate, 3PG 3-phosphoglycérate, PEP phosphoénolpyruvate, AIR amino imidazole ribonucléotide, IMP inosine monophosphate, GTP guanosine 5′-triphosphate, D-Ru5P d-ribulose 5-phosphate, FAD flavine adénine dinucléotide, FMN riboflavine-5-phosphate, DHF 7,8-dihydrofolate, THF tétrahydrofolate, AL (S)-2-acétolactate, OIV 2-oxoisovalérate, NAD+ nicotinamide adénine dinucléotide, NADP+ nicotinamide adénine dinucléotide phosphate.

De plus, de nombreux gènes d'enzymes catalysant le processus des branches non oxydatives de la voie des pentoses phosphates ont été codés par les SGB chez Fibrobacteres et Elusimicrobiota (Fig. 3 supplémentaire). Par exemple, la transcétolase [EC:2.2.1.1], la ribulose-phosphate 3-épimérase [EC:5.1.3.1], la ribose 5-phosphate isomérase A [EC:5.3.1.6] et la ribose-phosphate pyrophosphokinase [EC:2.7. 6.1] catalysent la conversion du fructose 6-phosphate en érythrose 4-phosphate (érythrose-4P) et en 5-Phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphate (PRPP). On sait que l'érythrose-4P est le substrat essentiel pour la synthèse du chorismate par la voie du shikimate. Le chorismate peut servir de précurseur pour la biosynthèse de la tyrosine, de la phénylalanine et du tryptophane. Et le PRPP est le précurseur clé de la synthèse d'histidine et de la formation d'amino imidazole ribonucléotide (AIR) et de guanosine triphosphate (GTP), qui sont utilisés pour la biosynthèse des vitamines B1, B2, B9, flavine adénine dinucléotide (FAD), flavine mononucléotide (FMN ) et le tétrahydrofolate (THF).

Les analyses d'enrichissement sur les voies métaboliques des Fibrobacteres et des Elusimicrobiota ont montré que les deux phylums étaient tous deux impliqués dans la synthèse de 20 acides aminés essentiels (Fig. 5, Fig. 4 supplémentaire et Tableau supplémentaire 7). Les SGB de Fibrobacteres encodaient plus de gènes d'enzymes apparentés que ceux d'Elusimicrobiota. Par exemple, les SGB de Fibrobacteres contenaient tous les gènes d'enzymes clés qui ont catalysé le PRPP pour former de l'histidine (9 gènes), de l'oxaloacétate en glutamate et ensuite de l'arginine (11 gènes), de l'oxaloacétate en aspartate (1 gène), de l'aspartate en lysine (7 gènes) et à la thréonine (5 gènes) ainsi qu'à la glycine (7 gènes), le 3-phosphoglycérate à la sérine (3 gènes), le pyruvate à l'alanine (2 gènes) et à la valine (5 gènes), l'érythrose-4P au chorismate et en plus du tryptophane (12 gènes). Les résultats ont indiqué que Fibrobacteres avait une plus grande capacité à synthétiser des acides aminés qu'Elusimicrobiota. Les SGB d'Elusimicrobiota ont codé les sept gènes d'enzymes clés dans la voie de synthèse de la lysine (7 gènes) et tous les gènes d'enzymes clés ont catalysé la conversion de la thréonine en glycine et ensuite en sérine, comme la thréonine 3-déshydrogénase [EC:1.1.1.103].

De plus, les SGB de Fibrobacteres et Elusimicrobiota contenaient plusieurs gènes enzymatiques dans les voies de synthèse des vitamines B et de leurs formes actives, à l'exception de la pyridoxine et de la cobalamine (Fig. 4 supplémentaire). Par exemple, les SGB de deux phylums bactériens comprenaient 10 gènes dans la voie de synthèse de la thiamine, 13 gènes dans la niacine, le nicotinamide et le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+), 11 gènes dans le pantothénate et la coenzyme A (CoA), 13 gènes dans la biotine, ainsi que 19 gènes dans l'hème. Il était remarquable que Fibrobacteres possédait tous les gènes d'enzymes essentiels pour catalyser le GTP pour former la riboflavine (7 gènes), le folate et le THF (12 gènes), indiquant leurs rôles importants dans la synthèse des vitamines B. Les SGB d'Elusimicrobiota contenaient plus de gènes d'enzymes dans la synthèse de niacine et de nicotinamide.

Dans cette étude, nous avons récupéré 8210 MAG de différentes races de porcs et les avons regroupés en 1050 SGB. Au moins 73,47 % des SGB appartenaient à de nouvelles espèces bactériennes non identifiées. Par rapport au plus grand ensemble de données sur le microbiome porcin29, il y avait encore 519 SGB uniques dans cette étude. Ces résultats suggèrent que cette étude peut élargir le répertoire des espèces connues et élargir la diversité phylogénétique connue du microbiote dans l'intestin du porc. De plus, les TP avaient plus de diversité microbienne que les CP et les EP, ce qui était cohérent avec la découverte selon laquelle les macaques rhésus chinois au Tibet possédaient une diversité microbienne intestinale plus élevée que celle des parents à basse altitude32. Cependant, Zeng et al.14 ont trouvé moins de diversité microbienne chez les porcs tibétains et les Tibétains que chez leurs parents de basse altitude. Worthmann et al.33 ont rapporté que l'exposition au froid entraînait une diminution de la richesse et une diminution de l'indice de diversité de Shannon chez la souris. La question de savoir si la haute altitude entraîne la formation de la diversité microbienne intestinale des animaux tibétains doit être clarifiée davantage. En outre, nous avons constaté que la différence de diversité bêta entre les types d'échantillons (contenu des matières fécales par rapport au caecum) était significativement plus faible que celle entre les groupes d'hôtes. Cela était cohérent avec notre découverte précédente selon laquelle la différence de diversité microbienne entre les sites le long de l'intestin humain était inférieure à la variation interindividuelle34.

Notre étude précédente a démontré l'évolution convergente des microbiomes du rumen chez le yack et le mouton tibétain pour la persistance de la récolte d'énergie de leurs hôtes35, indiquant que l'homéostasie énergétique médiée par les microbiomes intestinaux pourrait être vitale pour l'adaptation à haute attitude des mammifères. Dans cette étude, nous avons identifié de plus grandes quantités de gènes d'enzymes susceptibles de dégrader les polysaccharides, la cellulose et d'autres bêta-glucanes, l'hémicellulose, la chitine et la pectine dans les génomes microbiens associés à la TP, ce qui était cohérent avec l'étude précédente selon laquelle les microbiomes intestinaux de Les TP encodaient de nombreux gènes d'enzymes dégradant les glucides que ceux de leurs parents de basse altitude20. De plus, nous avons découvert une prévalence significativement élevée de Fibrobacterota et d'Elusimicrobia dans l'intestin des TP. Ils ont été impliqués dans la production d'énergie, comme le butyrate, l'acide acétique, le propionate, l'éthanol et le lactate. Le butyrate peut être absorbé par les cellules de l'épithélium colique pour maintenir l'intégrité de la barrière de la paroi intestinale et prévenir l'inflammation des entérocytes36. L'acide acétique et le propionate ont été absorbés dans la circulation sanguine et se sont rendus au foie pour alimenter le métabolisme énergétique des tissus37. Zheng et al.38 ont démontré qu'Elusimicrobia pouvait utiliser le glucose pour fermenter en lactate et en acide acétique, ce qui était cohérent avec notre découverte. Ainsi, nous avons déduit que le microbiote intestinal unique hébergé dans les TP pourrait améliorer l'utilisation d'un régime alimentaire riche en fibres pour favoriser le métabolisme énergétique pour l'adaptation de l'hôte aux environnements extrêmes à haute altitude.

L'hypoxie de haute altitude et les rayons UV sont des caractéristiques typiques du plateau Qinghai-Tibet2. Une grave privation d'oxygène pourrait augmenter les taux d'incidence des lésions pulmonaires39, des maladies cardiovasculaires40 et des lésions cérébrales41. Comme l'exposition à des rayons UV élevés a entraîné un vieillissement prématuré de la peau et de nombreux autres troubles cutanés influencés par l'environnement42. Dans cette étude, nous avons trouvé des potentiels fonctionnels de Fibrobacterota et Elusimicrobia dans la production de lactate, d'acides aminés (c'est-à-dire l'histidine et l'arginine) et de vitamines/cofacteurs (c'est-à-dire B2, B3, B9, THF et hème) (Fig. 5 , Supplémentaire Fig. 3 et Supplémentaire Fig. 4) étaient associés à la résistance à l'hypoxie et aux dommages causés par les rayons UV. Par exemple, le lactate était considéré comme un promoteur de la réponse hypoxique indépendante du facteur inductible par l'hypoxie (HIF) en se liant à la protéine NDRG3 pour favoriser l'angiogenèse et la croissance cellulaire43. L'arginine est un précurseur de l'oxyde nitrique (NO) qui est considéré comme le vasodilatateur naturel pour stimuler le flux sanguin et l'apport d'oxygène44. L'histidine peut être convertie en histamine pour jouer un rôle particulièrement important dans l'augmentation du flux sanguin et de la perméabilité capillaire45. Il peut également être converti en trans-uréthane et ensuite en cis-uréthane par les rayons UV pour protéger la peau46. La riboflavine et ses cofacteurs ont été bénéfiques pour maintenir les cellules sanguines en bonne santé, protéger la santé de la peau et améliorer l'endurance de l'hypoxie chez les jeunes adultes47,48. Le folate et le THF ont joué un rôle vital dans la répression de l'inflammation induite par l'hypoxie49, la formation de globules rouges et la production de mélanine pour la protection de la peau50. Le nicotinamide et la niacine ont été impliqués dans la prévention des dommages aux tissus pulmonaires51, ainsi que le NAD+ dans la prolongation de la durée de vie et de la santé52. L'hème est le précurseur important de l'hémoglobine qui est essentielle à la détection de l'oxygène, au transfert d'oxygène et au transfert d'électrons53,54. Ces résultats ont montré une association inattendue entre le microbiome intestinal et l'adaptation de l'hôte à l'hypoxie de haute altitude et aux rayons UV.

Notre étude fournit des informations sur la compréhension du rôle du microbiome intestinal dans l'adaptation à haute altitude des mammifères et présente certains microbes candidats pour l'exploration de probiotiques à l'avenir, tels que les membres de Fibrobacterota et Elusimicrobia qui sont significativement associés à la haute altitude. mammifères et contribuent potentiellement à l'adaptation de l'hôte à des environnements extrêmement difficiles dans le plateau Qinghai-Tibet. Cependant, nous ne pouvons toujours pas complètement démêler l'effet des différents modes de vie sur la divergence du microbiome intestinal chez les porcs tibétains et leurs parents des basses terres. À l'avenir, il est nécessaire de confirmer nos associations découvertes entre le microbiome intestinal et les traits de l'hôte en utilisant des modèles animaux sans germes colonisés par des bactéries intestinales cultivées dans le cadre d'expériences contrôlées.

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université du Yunnan pour les expérimentations animales.

Des échantillons de contenu frais de caecum (n = 34) et des échantillons de matières fécales (n = 31) ont été prélevés sur 47 porcs tibétains (femelles et mâles) broutant librement situés à 3500 m au-dessus du niveau de la mer dans la préfecture de Deqen dans la province du Yunnan en Chine dans des tubes de prélèvement stériles ( Tableau supplémentaire 1). Tous les échantillons ont été immédiatement congelés dans de la neige carbonique puis stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation.

Les extractions d'ADN ont été effectuées à l'aide du kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant, avec des étapes supplémentaires de perturbation mécanique et de protéine précipitée à l'acétate d'ammonium. La concentration et la pureté de l'ADN ont été mesurées à l'aide du NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA) et de l'électrophorèse sur gel d'agarose. La préparation de la bibliothèque de métagénomes a été réalisée dans une bibliothèque d'extrémités appariées d'ADN avec une taille d'insert de 300 paires de bases (pb) pour chaque échantillon en suivant les instructions du fabricant (Illumina, San Diego, CA, USA). L'échantillon a été séquencé sur une plateforme Illumina HiSeq × 10 adoptant une stratégie de séquençage PE de 150 pb.

Nous avons recueilli l'ensemble de données métagénomiques accessible au public de Xiao et al. study21, totalisant 1758 Go de lectures de haute qualité déposées dans l'European Nucleotide Archive (ENA) sous le code d'accession PRJEB11755. Les lectures brutes de séquençage ont été générées à partir de 287 porcs captifs à basse altitude (100 porcs de France, 100 porcs du Danemark et 87 porcs de Chine) avec une moyenne de 6,13 Gb par échantillon. Ces ensembles de données ont été intégrés à nos lectures brutes pour un assemblage métagénomique plus poussé.

Nos lectures brutes et nos lectures accessibles au public ont été filtrées pour supprimer les séquences de faible qualité, notamment celles : (1) plus de 40 % de bases continues dont le score de qualité était inférieur à 32 bp ; (2) plus de 10 % de bases N. Ensuite, la qualité des lectures a été davantage contrôlée en utilisant Trimmomatic pour filtrer les adaptateurs de lecture de mauvaise qualité et les lectures de qualité inférieure55. Nous avons obtenu un total de lectures propres de haute qualité de 2,3 To pour 352 échantillons avec une moyenne de 6,6 Go par échantillon. MEGAHIT (v1.0)56 a été utilisé pour assembler individuellement toutes les lectures propres dans chaque échantillon. Les contigs de longueur> 500 bp ont été alignés sur les lectures à l'aide de BWA (v.0.7.12) 57. La couverture et la profondeur des contigs ont ensuite été calculées en utilisant Samtools (v.1.9)58 et Bedtools (v.2.27.1)59. Nous avons effectué MetaBAT260 pour regrouper les contigs assemblés en génomes putatifs (MAG) dans chaque échantillon en fonction de la fréquence des tétranucléotides et de l'abondance (ou profondeur moyenne) des contigs. Par la suite, CheckM (v.1.0.7)61 a été utilisé pour estimer l'exhaustivité et la contamination des MAG par des gènes marqueurs spécifiques à la lignée et des paramètres par défaut. Généralement, les MAG récupérés avec une complétude > 50 % et une contamination < 10 % étaient considérés comme de qualité moyenne ou élevée62,63,64, mais nous avons établi un seuil plus strict pour une qualité moyenne comme complétude > 75 % et contamination < 10 %22,23 . Les MAG avec une complétude > 75 % et une contamination < 10 % ont été conservés pour un raffinement et une validation supplémentaires. Nous avons utilisé RefineM (v.0.0.14)22 pour filtrer les bacs avec des propriétés génomiques divergentes, avec une classification taxonomique incongrue et avec des gènes d'ARNr 16 S incongrus en utilisant des paramètres par défaut. CheckM (v.1.0.7) a été réexécuté pour évaluer la qualité du génome des MAG retenus. 8210 MAG de qualité moyenne élevée (complétude 75 % et contamination 10 %) ont été obtenus. Ensuite, ces MAG ont été regroupés en génomes au niveau de l'espèce à l'aide de dRep (v.2.6.2)65 avec les paramètres par défaut de Mash66 et ANIs67 (au seuil de 95%). Les génomes avec un score de qualité génomique maximal (complétude-5X contamination + 0,5logN50) dans chaque groupe ont été sélectionnés comme SGB représentatifs. Les SGB avec une couverture supérieure à 40 % dans un échantillon ont été déterminés comme étant présents dans cet échantillon. Ainsi, un total de 1048 SGB représentatifs dans l'intestin de porc ont finalement été reconstruits dans cette étude (tableau supplémentaire 2).

GTDB-Tk (v.1.4.0)25 a été utilisé pour effectuer des affectations taxonomiques de 1048 SGB représentatifs basés sur GTDB (version 95) (tableau supplémentaire 3). Les arbres phylogénétiques des SGB ont été construits par FastTree (v.2.1.10)68 et visualisés à l'aide d'iTOL (v.6.6)69.

Les cadres de lecture ouverts (ORF) ont été prédits à l'aide de MetaGeneMark (v.3.38)26 dans chaque SGB. Tous les ORF ont été cartographiés dans la base de données des gènes KEGG (v.96) pour annoter les KO et alignés sur la base de données CAZy à l'aide de dbCAN231 pour annoter les CAZymes. Les substrats glucidiques des gènes contenant CAZyme ont été obtenus en utilisant la base de données dbCAN-PUL.

La richesse en espèces a été calculée sur la base de la présence ou de l'absence de chaque SGB dans chaque échantillon (voir fichier de données source) par package Vegan. L'indice de diversité de Shannon et Simpson a été calculé sur la base de l'abondance de chaque SGB dans chaque échantillon (voir fichier de données source) par package Vegan. L'abondance ou la profondeur de chaque SGB a été calculée sur la base de la formule : longueur de base totale cartographiée dans le génome divisée par la taille du génome. La différence statistique de diversité alpha entre les quatre groupes a été mesurée en utilisant le test de somme des rangs de Wilcoxon. L'analyse de tracé PCoA a été effectuée sur la base de la matrice de distance UniFrac pondérée entre les échantillons en utilisant le package Phyloseq. L'analyse de tracé NMDS a été effectuée sur la base de la matrice de distance Jaccard entre les échantillons en utilisant le package Vegan. L'analyse d'enrichissement de chaque SGB dans chaque groupe a été mesurée en fonction de leur présence ou de leur absence dans chaque échantillon. La différence statistique dans chaque enrichissement SGB entre les trois groupes a été analysée par le test de somme des rangs de Wilcoxon. Les SGB enrichis dans chaque groupe ont été annotés CAZymes, puis en fonction du nombre de CAZymes annotés dans chaque groupe, nous avons effectué l'analyse d'enrichissement en utilisant le test exact de Fisher. Tous les SGB des phyla Fibrobacteres et Elusimicrobiota ont été affectés à leurs KO annotés. Nous avons utilisé le test exact de Fisher pour analyser l'enrichissement de la voie KEGG de chaque phylum en fonction du rapport entre le nombre de KO annotés et le nombre total de KO dans la certaine voie.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de séquence brutes et les profils MAG ont été déposés dans les archives de séquence CNGB (CNSA) de la base de données de la banque nationale de gènes de Chine (CNGBdb) avec le numéro d'accès CNP0003325. Ils sont également disponibles sur https://db.cngb.org/qtp/. Les données sources sous-jacentes aux Figs. 1–2 et les figures supplémentaires 1–2 sont fournies sous forme de fichier de données source.

Les informations détaillées du code utilisé pour effectuer nos analyses de données sont disponibles dans les documents supplémentaires.

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Cette étude a été soutenue par le programme d'expédition et de recherche scientifiques du deuxième plateau tibétain (STEP) (NO. 2019QZKK0503), la Fondation nationale chinoise des sciences naturelles (NO. U2002206 et 31970571), le projet majeur de science et de technologie dans la province chinoise du Yunnan (NO . 202001BB050001), le programme de recherche clé de l'Académie chinoise des sciences (NO. KFZDSW-219) et le projet d'innovation de recherche des diplômés de l'Université du Yunnan (NO. KC-22221159).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Fangfang Zhao, Lili Yang, Tao Zhang.

State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming, Yunnan, 650091, Chine

Fangfang Zhao, Tao Zhang, Daohua Zhuang, Qunfu Wu, Jiangkun Yu, Chen Tian et Zhigang Zhang

Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology, Faculté des sciences et technologies animales, Université agricole du Gansu, Lanzhou, Gansu, 730070, Chine

Fangfang Zhao

State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution, Laboratory of Evolutionary & Functional Genomics, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Yunnan, 650201, Chine

Lili Yang, Qunfu Wu et Zhigang Zhang

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ZGZ a conçu et conçu la recherche. DHZ, FFZ, CT, LLY et TZ ont analysé les données. QFW a contribué à la collecte des échantillons. JKY a contribué aux méthodes. FFZ et ZGZ ont rédigé le manuscrit. ZGZ a révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale avant la soumission.

Correspondance à Zhigang Zhang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Zhao, F., Yang, L., Zhang, T. et al. Signatures du microbiome intestinal de l'adaptation à l'environnement extrême chez le porc tibétain. npj Biofilms Microbiomes 9, 27 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00395-3

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Reçu : 09 août 2022

Accepté : 10 mai 2023

Publié: 24 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00395-3

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