Le paysage métabolique de l'intestin de la souris mâle identifie différentes niches déterminées par les activités microbiennes

Nature Metabolism (2023)Citer cet article

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Des niches distinctes de l'intestin des mammifères sont peuplées de divers microbiotes, mais la contribution de la variation spatiale au métabolisme intestinal reste incertaine. Nous présentons ici une carte du métabolome longitudinal le long de l'intestin de souris mâles saines colonisées et exemptes de germes. Avec cette carte, nous révélons un déplacement général des acides aminés dans l'intestin grêle vers les acides organiques, les vitamines et les nucléotides dans le gros intestin. Nous comparons les paysages métaboliques chez les souris colonisées par rapport aux souris sans germes pour démêler l'origine de nombreux métabolites dans différentes niches, ce qui, dans certains cas, nous permet de déduire les processus sous-jacents ou d'identifier les espèces productrices. Au-delà de l'impact connu du régime alimentaire sur la niche métabolique de l'intestin grêle, des schémas spatiaux distincts suggèrent une influence microbienne spécifique sur le métabolome de l'intestin grêle. Ainsi, nous présentons une carte du métabolisme intestinal et identifions les associations métabolite-microbe, qui fournissent une base pour relier l'occurrence spatiale des composés bioactifs au métabolisme de l'hôte ou du micro-organisme.

L'intestin des mammifères est peuplé d'une grande variété de micro-organismes, collectivement appelés le microbiote intestinal1,2. Le microbiote contribue à la digestion et aux fonctions immunitaires, et sa perturbation est liée à de multiples maladies3,4. En plus des fonctions digestives et de la prévention (ou de la cause) des infections, les micro-organismes intestinaux sont également une source de composés bioactifs qui influencent l'hôte et d'autres micro-organismes3. L'intestin grêle et le gros intestin sont physiologiquement les plus distincts et sont colonisés par des compositions conservées de taxons4,5. Le duodénum reçoit des nutriments alimentaires, des sécrétions pancréatobiliaires et gastriques. Les différences régionales dans la perméabilité tissulaire, les protéines de transport absorbantes, le pH, la signalisation régulatrice et les réponses immunitaires distinguent davantage les sous-régions jéjunale et iléale dans l'intestin grêle5. Le profilage communautaire dans des modèles animaux a démontré des compositions de microbiote distinctes dans les différentes régions intestinales4,6,7. Au-delà de ces différences longitudinales, il existe une variation considérable en termes de physiologie et de composition du microbiote entre le contenu luminal et le mucus intestinal8. Ce dernier est une matrice dense, en particulier dans le côlon, constituée de glycoprotéines de mucine réticulées séparant les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale de la lumière et de son microbiote9. L'épaisse couche de mucus externe du côlon représente également un habitat et une source de nutriments pour les micro-organismes spécialisés dans la dégradation de la mucine8,10. Les Clostridia qui peuplent et dégradent le mucus intestinal, certains Firmicutes qui produisent des acides gras à chaîne courte caractéristiques ou des dérivés d'acides aminés caractéristiques dans le gros intestin, ou des bactéries productrices de vitamines spécifiques dans divers sites intestinaux3, illustrent l'amélioration des connaissances sur le paysage fonctionnel du tube digestif. ,11,12,13,14,15.

Les différences biogéographiques dans la composition taxonomique et l'activité métabolique ne peuvent pas être évaluées à l'aide d'échantillons fécaux car elles restreignent probablement le pouvoir explicatif, dans certaines limites, au côlon distal4,16. Cela est particulièrement vrai pour l'intestin grêle, où l'apport alimentaire, les temps de transition rapides et la sécrétion d'enzymes digestives et d'antimicrobiens dominent les processus intestinaux et façonnent le microbiome6,17,18. Pour tendre vers la causalité, des informations détaillées sur les populations bactériennes et leurs processus métaboliques dans différentes sous-régions intestinales peuvent aider à identifier l'origine des métabolites. La majorité des composants de l'alimentation sont métabolisés et absorbés dans l'intestin grêle, laissant des fibres et des xénobiotiques ainsi qu'une petite fraction de protéines et de lipides ingérés disponibles pour le microbiote colique proximal17. Ainsi, une grande partie de l'activité microbienne n'est pas apparente dans les échantillons fécaux, y compris de nombreux composés bioactifs d'origine microbienne qui sont également présents dans l'intestin grêle19. L'analyse de l'activité microbienne dans l'intestin grêle de l'homme nécessite une intervention chirurgicale, une intubation perorale très étendue ou une purge avant l'endoscopie. Par conséquent, des modèles animaux sont utilisés pour étudier l'intestin dans son intégralité20,21. Un exemple récent a rapporté des concentrations de métabolites sur toute la longueur de l'intestin chez des souris colonisées, découvrant de nouveaux conjugués d'acides biliaires dérivés du microbiote qui affectent la chimie de tous les organes, établissant un lien de causalité entre les micro-organismes et leur effet sur l'hôte7. Compte tenu du grand nombre de micro-organismes différents dans les différentes niches intestinales et de leurs diverses activités métaboliques, ces acides biliaires nouvellement découverts ne sont qu'un exemple illustrant l'énorme espace d'interactions hôte-microbe et microbe-microbe basées sur les métabolites qui attendent d'être dévoilées.

Ici, nous caractérisons le métabolisme intestinal local et la composition de la communauté dans le contenu luminal et le mucus de 15 sites le long de l'intestin de souris mâles en bonne santé exemptes d'agents pathogènes spécifiques (SPF) et sans germes. En plus de caractériser les quatre principaux habitats intestinaux du contenu luminal et du mucus dans l'intestin grêle et le gros intestin, ce paysage métabolique a révélé des processus métaboliques auparavant non pris en compte dans l'intestin grêle. En outre, nous avons identifié 35 composés intestinaux comme métabolites dérivés de micro-organismes représentant une base pour des études sur le métabolisme intestinal spécifique à une niche.

Pour tracer systématiquement la composition du métabolome le long du tractus intestinal, nous avons échantillonné l'ensemble de l'intestin de cinq souris mâles SPF C57BL / 6J à 15 emplacements distincts (données étendues Fig. 1a) et avons séparé le contenu luminal du mucus intestinal. Pour minimiser la variabilité biologique, des souris âgées de 10 à 14 semaines ont reçu un régime de laboratoire standard ad libitum et ont jeûné pendant 4 h avant l'échantillonnage, de sorte que le volume de nourriture atteigne le caecum21. Chaque échantillon de métabolome contenait des métabolites microbiens intracellulaires ainsi que des métabolites extracellulaires dérivés de l'alimentation, de la souris ou de l'activité microbienne, et était donc un mélange complexe de classes de composés chimiques à des concentrations élevées en sel. Pour quantifier ces composés pertinents pour l'intestin, nous avons adopté un flux de travail de spectrométrie de masse à temps de vol par chromatographie liquide (LC-TOF-MS)22. En bref, nous avons optimisé le temps d'exécution de la méthode et établi un mélange de normes analytiques pour quantifier 138 métabolites caractéristiques du métabolome intestinal, y compris des composés du métabolisme des acides aminés et des nucléotides, des sucres et d'autres sources de carbone, des acides biliaires et des produits de fermentation (Extended Data Fig. 1b et tableau supplémentaire 1). Sur ces 138 métabolites, 128 ont pu être quantifiés de manière fiable sur la base de paramètres de contrôle de la qualité (tableau supplémentaire 1 et données supplémentaires). La concentration moyenne dans la lumière intestinale du SPF de ces métabolites était d'environ 290 nmol mg-1 d'échantillon dans l'intestin grêle et de 1,5 µmol mg-1 dans le gros intestin.

L'analyse spatialement résolue du contenu luminal SPF et du mucus nous a permis de caractériser le paysage métabolique hétérogène de l'intestin de la souris. Les profils de métabolites sur 15 sites ont été regroupés hiérarchiquement pour le contenu (Fig. 1a) et, pour faciliter la comparaison, les profils de mucus ont été triés en fonction des clusters de contenu (Extended Data Fig. 1c). Les acides biliaires, les acides aminés et leurs dérivés étaient détectables dans tous les sites mais présentaient des schémas spatiaux distincts avec trois sites principaux de concentrations maximales : l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin. Le contenu de l'estomac était caractérisé par des concentrations élevées principalement d'acides aminés (Fig. 1a). Les acides aminés protéinogènes et leurs dérivés ont été trouvés presque exclusivement dans l'intestin grêle. Le gros groupe intestinal était dominé par les acides organiques, les vitamines et les composés du métabolisme des nucléotides. L'analyse en composantes principales (ACP) a séparé l'intestin grêle et le gros intestin, principalement entraînés par les acides aminés et leurs dérivés le long du premier composant principal, corroborant les différences globales entre les deux régions (Fig. 1b). Dans le gros intestin, le deuxième composant principal sépare davantage les profils métabolomes du contenu luminal du mucus. Dans l'ensemble, les concentrations de métabolites dans le contenu luminal étaient en moyenne 1, 7 fois plus élevées que dans le mucus avec des acides biliaires, des sources de carbone, des dérivés d'acides aminés et des acides organiques comme moteurs de la séparation (Fig. 1c et Tableau supplémentaire 2). Seuls la spermidine, la créatine et le malate étaient significativement plus abondants dans le mucus que dans les échantillons luminaux (P ≤ 0,05, changement de facteur ≥ 3). Des concentrations élevées de spermidine étaient vraisemblablement une conséquence de la production microbienne de polyamines, qui est importante pour maintenir une couche de mucus saine, en particulier dans le gros intestin23 (Fig. 1c et Extended Data Fig. 1d). Conformément à des concentrations de polyamines plus élevées, les concentrations des précurseurs de polyamines arginine et ornithine étaient plus faibles dans le gros mucus intestinal que dans le contenu luminal (données étendues Fig. 1d et tableau supplémentaire 2).

a, analyse de regroupement hiérarchique des abondances de métabolites à partir d'échantillons de contenu luminal de souris SPF mâles. Les abondances pour les 128 métabolites quantifiés sont présentées sous forme de concentrations normalisées par score z, moyennées à partir de cinq souris, sur les 15 sites d'échantillonnage. Le regroupement basé sur la distance euclidienne a permis d'identifier trois groupes principaux correspondant aux trois principales régions physiologiques du tube digestif : l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin. Les métabolites sont codés par couleur selon MetaCyc (en bas à droite). b, PCA des concentrations de métabolites de souris SPF mâles individuelles basées sur les 150 échantillons luminaux et de mucus couvrant l'ensemble de l'intestin. L'ACP a été réalisée sur des concentrations de métabolites normalisées par score z, avec cinq souris par échantillon. Les couleurs indiquent les sites regroupés par région intestinale, les symboles indiquent la lumière ou le mucus et le groupe de contenu du gros intestin est surligné en gris. c, Analyse différentielle des concentrations de métabolites entre le contenu luminal et les échantillons de mucus. Les concentrations ont été moyennées sur les 15 sites d'échantillonnage pour cinq souris mâles dans l'habitat respectif. Des changements de pli positifs ou négatifs indiquent des concentrations plus élevées dans la lumière ou le mucus, respectivement. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t de Student à échantillon apparié bilatéral avec correction de Benjamini-Hochberg pour les tests multiples et sont affichées sous la forme -log10 transformé. Les métabolites présentant des concentrations significativement différentes (log2 absolu (multiplication) ≥ 1,5, P corrigé ≤ 0,05) sont colorés selon la classification MetaCyc, telle que définie dans l'encadré ci-dessous. Les types d'échantillonnage de lumen et de mucus sont représentés schématiquement à gauche, alignés sur les parties correspondantes de la parcelle du volcan. Abréviations : FC, changement de pli.

Données source

Pour identifier les métabolites spécifiques qui distinguent l'intestin grêle du gros intestin, nous avons calculé les changements de pli à partir des concentrations moyennes de métabolites dans l'intestin grêle et le gros intestin, séparément pour le contenu luminal et le mucus, entre les sites d'échantillonnage et les individus. Cette analyse différentielle a révélé des concentrations élevées d'acides aminés et de métabolites apparentés dans l'intestin grêle, en particulier dans le mucus (Fig. 2a, b et tableau supplémentaire 3). Compte tenu de la couche de mucus plutôt mince dans l'intestin grêle, nous ne pouvons pas exclure que les concentrations plus élevées d'acides aminés protéinogènes puissent, au moins en partie, être causées par un transfert de la lumière lors de l'échantillonnage. Des exemples représentatifs étaient l'histidine et le tryptophane, dont les concentrations étaient constamment plus élevées dans tout l'intestin grêle et tombaient immédiatement dans le gros intestin (Fig. 2c). Le gros intestin était caractérisé par des concentrations plus élevées d'acides organiques, de vitamines et de composés dans le métabolisme des acides aminés et des nucléotides (Fig. 2a, b). Dans l'ensemble, 31 métabolites avaient des concentrations au moins quatre fois plus élevées dans le contenu luminal ou le mucus du gros intestin avec sa charge bactérienne plus élevée par rapport à l'intestin grêle (tableau supplémentaire 3), indiquant une activité microbienne. La forte augmentation des acides gras à chaîne courte tels que le butyrate / isobutyrate, les produits de dégradation des sucres tels que le glycérate et les produits de dégradation des acides aminés tels que le 4-hydroxyphénylacétate a indiqué une fermentation microbienne importante (Fig. 2d). Même si la PCA n'a pas distingué les régions dans le mucus intestinal (Fig. 1b), l'analyse différentielle a révélé un changement métabolique distinct des acides aminés vers les produits de fermentation dans le mucus (Fig. 2a (en bas), Fig. 2b (à droite) et Fig. 2c ), fournissant des preuves de différences métaboliques entre les petits et les grands habitats du mucus intestinal.

a, Analyse différentielle des concentrations de métabolites entre les petits et gros échantillons intestinaux dans la lumière (supérieure) et le mucus (inférieur). Les points de données représentent les valeurs moyennes de changement de pli calculées entre dix sites de l'intestin grêle et quatre sites du gros intestin, pour cinq souris mâles. Les valeurs négatives et positives représentent des concentrations plus élevées dans l'intestin grêle ou le gros intestin, respectivement. L'axe y affiche les valeurs P transformées en −log10, calculées à l'aide d'un test t de Student à échantillon apparié bilatéral avec correction de Benjamini–Hochberg pour les tests multiples. Les métabolites avec des concentrations significativement différentes (log2 absolu (multiplication) ≥ 2, P corrigé ≤ 0,05) sont codés par couleur selon la classification MetaCyc, telle que définie dans l'encadré (en bas à gauche). b, Changement significatif des métabolites entre l'intestin grêle et le gros intestin dans la lumière et le mucus à partir de l'analyse différentielle de la Fig. 1a (log2 absolu (variation de facteur) ≥ 2, P corrigé ≤ 0,05). Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t de Student bilatéral pour échantillons appariés avec correction de Benjamini-Hochberg pour les tests multiples. Les couleurs des points indiquent le changement de pli et la taille des points indique la signification. Les métabolites sont classés selon MetaCyc, tel que défini dans l'encadré (en bas à gauche). c, d, Profils spatiaux de l'histidine et du tryptophane (c) et du glycérate et du 4-hydroxyphénylacétate (d) sur 15 sites intestinaux dans le mucus ou la lumière SPF, respectivement. Les lignes avec des zones ombrées indiquent la moyenne mobile de la moyenne ± sem des mesures de concentration de cinq souris mâles. Abréviations : cec, caecum ; col, côlon ; duo, duodénum ; ile, iléon ; jej, jéjunum ; STO, estomac ; TMAO, N-oxyde de triméthylamine.

Données source

Le schéma global du métabolome ne nous a pas permis de distinguer les sites individuels dans l'intestin grêle ou le gros intestin, car les différences entre les souris individuelles à ces sites étaient, comme prévu24, tout aussi importantes (Fig. 1b), mais environ un tiers des métabolites présentaient des différences longitudinales distinctes. profils (Fig. 3 et tableau supplémentaire 4). Le regroupement hiérarchique des concentrations de métabolites dans l'intestin grêle a abouti à trois groupes : les métabolites avec une concentration maximale dans le duodénum, ​​le jéjunum ou l'iléon (Extended Data Fig. 2). Bien que les trois classes aient été réparties de manière égale dans les échantillons luminaux, la plupart des concentrations de mucus ont diminué vers l'iléon dans les échantillons d'intestin grêle (données étendues Fig. 2b, c). Les métabolites à fortes concentrations dans le duodénum comprenaient le fructose (Fig. 3a) et d'autres monosaccharides, vraisemblablement des composants alimentaires résiduels qui avaient été absorbés par l'hôte avant d'atteindre l'intestin grêle distal14,25. Les concentrations de riboflavine étaient les plus élevées dans le contenu du jéjunum, provenant soit de la production microbienne, soit des vitamines alimentaires résiduelles14,15,26. Des concentrations élevées d'allantoïne dans le contenu iléal (Fig. 3a) résultaient probablement de la dégradation microbienne des métabolites puriques dans la partie supérieure de l'intestin grêle de souris coprophages27, ce qui correspond à des concentrations élevées de guanine et de guanosine dans le mucus du duodénum (Fig. 3b) et à l'afflux majeur de guanine. et la guanosine par le biais du régime alimentaire. Des concentrations élevées de créatine dans le mucus jéjunal peuvent être le résultat de la créatine alimentaire, alors que la diminution de la concentration était probablement due à l'absorption par des cellules intestinales nécessitant une énergie élevée qui expriment divers transporteurs de créatine et enzymes métabolisant la créatine28. Dans le gros intestin, le regroupement hiérarchique a révélé des concentrations maximales de contenu luminal principalement dans le côlon distal, tandis que les concentrations maximales de mucus étaient réparties plus uniformément dans le gros intestin (Extended Data Fig. 3). Dans le contenu luminal, les concentrations d'uracile étaient les plus élevées dans le côlon distal, tandis que le butyrate/isobutyrate semblait diminuer légèrement vers le côlon distal (Fig. 3c) où le butyrate est la principale source d'énergie des colonocytes29. Dans le gros mucus intestinal, le produit de dégradation du fructose, le glycérate25, a culminé dans le caecum mais a chuté brusquement dans le côlon. Au total, nos données suggèrent l'activité microbienne comme un facteur possible contribuant aux profils de concentration longitudinale de 42 petits métabolites intestinaux.

a–c, Exemples de profils de métabolites avec une concentration différentielle dans le contenu de l'intestin grêle (a) et le mucus (b), ou dans le contenu luminal ou le mucus du gros intestin (c). Les lignes avec des zones ombrées indiquent la moyenne mobile de la moyenne ± sem des mesures de concentration de cinq souris mâles. Les concentrations de métabolites significativement différentes d'une région de l'intestin grêle par rapport à la région voisine sont marquées par des astérisques (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Concentration du contenu intestinal en fructose dans le duodénum versus le jéjunum : P = 0,0245 ; concentrations de contenu intestinal en riboflavine dans le jéjunum par rapport à l'iléon : P = 0,0432 ; concentrations de contenu intestinal d'allantoïne dans le jéjunum par rapport à l'iléon : P = 0,0220 ; concentrations de mucus de guanine dans le duodénum versus le jéjunum : P = 0,0005 ; concentrations de mucus de guanosine dans le duodénum versus le jéjunum : P = 0,0129 ; concentrations de mucus de créatine dans le jéjunum par rapport à l'iléon : P = 0,0278. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t de Student à deux échantillons appariés. Abréviations : sto, estomac ; duo, duodénum ; jej, jéjunum ; ile, iléon ; cec, caecum ; et col, côlon.

Données source

Cette carte du métabolisme intestinal chez les souris SPF met en évidence le contenu luminal et le mucus de l'intestin grêle et du gros intestin en tant que niches principales avec un schéma de métabolome largement cohérent sur plusieurs sites d'échantillonnage. Le passage général des concentrations plus élevées d'acides aminés et de leurs dérivés dans l'intestin grêle aux vitamines et aux produits de fermentation dans le gros intestin est vraisemblablement causé par une plus grande activité microbienne dans le gros intestin, indiquant une origine microbienne pour 31 métabolites. De plus, nous avons quantifié des modèles substantiels dans l'intestin grêle pour 42 des 128 métabolites mesurés. Parce que ces différences métaboliques pourraient, au moins en partie, résulter de l'activité microbienne dans différentes régions de l'intestin, nous avons ensuite étudié le rôle du microbiote.

Des concentrations élevées de métabolites dans le gros intestin (Fig. 2a), connu pour son activité microbienne étendue13,14,29, et le schéma spatial des métabolites dans l'intestin grêle (Fig. 3) n'ont fourni que des preuves indirectes d'une origine microbienne. En plus d'être dérivés de micro-organismes, ces métabolites pourraient également être des métabolites de l'hôte produits en réponse à des micro-organismes, des composants alimentaires résiduels ou des métabolites intracellulaires provenant de cellules intestinales excrétées. Pour obtenir des preuves plus directes de l'influence microbienne sur le métabolisme intestinal et pour disséquer les changements longitudinaux dans les métabolites affectés, nous avons réalisé une expérience d'appariement avec cinq souris mâles sans germes C57BL/6J, dont le contenu intestinal et le mucus ont été échantillonnés aux mêmes 15 sites après jeûne. Généralement, au moins les deux tiers des métabolites avaient des concentrations plus élevées en présence de bactéries ; près de 50% du contenu luminal et 30% des métabolites du mucus avaient des concentrations au moins deux fois plus élevées chez les souris SPF que chez les souris sans germes (données étendues Fig. 4a et tableaux supplémentaires 5 et 6). Les métabolites avec des concentrations particulièrement élevées chez les souris SPF comprenaient les acides biliaires, les acides organiques, les composés aromatiques, les vitamines et les dérivés d'acides aminés (tableaux supplémentaires 5 et 6). Seulement environ un quart des métabolites étaient plus abondants chez les souris sans germes, principalement des sources de carbone et des composés du métabolisme des nucléotides ainsi que des acides aminés qui pourraient être d'origine alimentaire et sont épuisés par le microbiote chez les souris SPF30.

Parmi les 31 métabolites d'origine microbienne potentielle ci-dessus, 24 avaient des concentrations moyennes au moins quatre fois plus élevées dans le gros intestin des souris SPF par rapport aux souris sans germes (Fig. 4a et tableau supplémentaire 7). Les acides gras à chaîne courte butyrate/isobutyrate et isovalérate/valérate, et les acides biliaires secondaires lithocholate et hyodésoxycholate avaient des concentrations au moins 14 fois plus élevées dans le gros intestin des souris SPF. Ces concentrations élevées sont cohérentes avec leur formation bien connue par les Bacteroidales abondantes à faible teneur en oxygène et à faible pH dans le côlon4,31. La biotine, l'indole-3-propionate et le glycérol ont été détectés exclusivement chez les souris SPF, fournissant des preuves solides de leur origine microbienne. L'indole-3-propionate est un composé bien établi dérivé du microbiote intestinal résultant du métabolisme du tryptophane13,32. Pour la plupart des 31 métabolites du gros intestin, notre hypothèse d'origine microbienne était cohérente avec des études ciblées ou des niveaux précédemment observés plus élevés chez les souris colonisées que chez les souris sans germes3,19,30,32,33 (Fig. 4a et Tableau supplémentaire 7 ). La concentration plus élevée en SPF du métabolite intracellulaire omniprésent 2-oxoglutarate (Fig. 4b) s'explique très probablement par la charge bactérienne élevée, comme décrit précédemment34. Les métabolites d'origine microbienne nouvellement identifiés étaient l'hydrocinnamate, le 3-hydroxybutyrate, le caproate, l'adénosine et le fucose/rhamnose (Fig. 4c et Extended Data Fig. 4b). Semblable au phénylacétate et au 4-hydroxyphénylacétate, l'hydrocinnamate peut résulter de la fermentation d'acides aminés aromatiques, comme montré in vitro pour plusieurs micro-organismes intestinaux35. De même, le 3-hydroxybutyrate et le caproate sont des produits de fermentation36. Les sucres tels que le fucose/rhamnose sont très probablement libérés des fibres alimentaires par les glycosides hydrolases microbiens sécrétés. Conformément aux observations précédentes19,30, les concentrations plus élevées de créatine et de guanosine dans le gros intestin chez les souris sans germes suggèrent une origine de l'hôte ou du régime alimentaire (Fig. 4a). Au total, des concentrations de métabolites plus élevées chez les souris SPF que chez les souris sans germes fournissent ainsi des preuves à l'appui de l'origine microbienne ou de la production d'hôte induite par le microbiote de 24 des 31 métabolites à fortes concentrations dans le gros intestin.

a, Changements de pli d'abondance de 31 métabolites avec des concentrations plus élevées dans le gros intestin que dans l'intestin grêle, donc supposées être d'origine microbienne (métabolites changeant de manière significative à partir de l'analyse différentielle; Fig. 2a, b). Les changements de pli transformés en log2 pour le contenu luminal (à gauche) et le mucus (à droite) ont été calculés à partir des concentrations moyennes pour les quatre sites d'échantillonnage du gros intestin de cinq souris mâles SPF par rapport à cinq souris mâles sans germes. Les boîtes à moustaches sont donc basées sur 20 points de données, le log2 médian (changement de pli) est indiqué en rouge, les boîtes contiennent les 25e au 75e centiles et les moustaches s'étendent aux points de données les plus extrêmes non considérés comme des valeurs aberrantes. La zone grise marque le log2 absolu (variation de pli) ≤ 2. Les symboles sur la gauche indiquent des preuves antérieures : () connaissances courantes sur certains métabolites, par exemple, voir Koh et al. et de Aguiar Vallim et al.29,66 ; (Δ) preuve de Han et al.19 utilisant la comparaison de souris Swiss-Webster sans germes par rapport à des souris conventionnelles pour identifier les abondances différentielles de métabolites ; (□) preuves de Matsumoto et al.33 utilisant des souris sans germes et «ex-sans germes» qui ont été inoculées dans l'estomac avec une suspension fécale de souris SPF BALB/c pour classer les métabolites comme dérivés de souris ou de micro-organismes ; () preuves de Marcobal et al.30 qui ont utilisé des souris Swiss-Webster sans germes et conventionnelles pour comparer les niveaux de métabolites ; () preuve de Sridharan et al.32 utilisant des modèles de réseau de réaction pour prédire les produits métaboliques dépendants du microbiote. Toutes les données utilisées à partir des travaux publiés, y compris les explications, peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 7. En outre, (◯) désigne les métabolites détectés exclusivement chez les souris SPF mâles. Pour les métabolites exclusifs SPF, les changements de pli ne peuvent pas être calculés, comme indiqué par ∞. b, c, grande concentration intestinale de 2-oxoglutarate (b) et d'hydrocinnamate (c) dans le SPF et le contenu luminal et le mucus exempts de germes. Les barres pleines montrent la concentration moyenne des mesures de cinq souris mâles, en moyenne sur les quatre gros sites intestinaux. Les 20 points de données correspondants sont affichés sous forme de cercles. Abréviations : FC, changement de pli ; cont, contenu luminal ; GF, exempt de germes ; muc, mucus.

Données source

Pour exclure les contributions alimentaires aux concentrations élevées de métabolites, nous avons déterminé la composition des granulés de régime alimentaire à l'aide de la spectrométrie de masse à temps de vol d'analyse par injection de flux non ciblée (FIA-TOF-MS)37. En bref, nous avons dissous et extrait trois granulés alimentaires selon le protocole utilisé pour les échantillons intestinaux. Sur la base de modèles de masse et d'isotopes précis, nous avons supposément annoté 1 379 ions métabolites. Malgré les différences d'efficacité d'ionisation, les intensités mesurées nous ont permis d'estimer grossièrement l'abondance relative des composés détectés. La distribution des abondances apparentes était remarquablement asymétrique. Dix-sept métabolites représentaient 50 % du signal total enregistré dans les pastilles (tableau supplémentaire 9), les disaccharides étant le principal contributeur (14 % en moyenne). Les autres métabolites abondants étaient l'adénine, le malate, les hexoses, la lysine, la guanosine, la guanine et le tryptophane. Des concentrations alimentaires élevées des nucléotides puriques guanosine et guanine expliquent leur abondance chez les souris sans germes et de faibles concentrations dans l'intestin SPF où nous avons observé une augmentation concomitante de l'allantoïne, produit de dégradation des purines. Plus important encore, aucun des 24 métabolites que nous avons trouvés liés au microbiote n'a contribué à plus de 0,05 % à la composition du régime alimentaire. Ainsi, l'abondance de ces marqueurs dans l'alimentation semble avoir un rôle mineur.

Enfin, nous avons recherché des preuves d'origine microbienne parmi les 42 métabolites présentant un profil longitudinal dans l'intestin grêle de souris SPF. À l'exception du phényllactate, aucun d'entre eux ne correspondait à notre critère d'une concentration quatre fois plus élevée chez les souris SPF par rapport aux souris sans germes lors de la moyenne sur les dix sites d'échantillonnage (Extended Data Fig. 5a). Dans des endroits spécifiques de l'intestin grêle, cependant, huit contenus luminaux et deux métabolites de mucus ont atteint des concentrations quatre fois plus élevées chez les souris SPF que chez les souris sans germes lorsque l'on considère séparément le duodénum, ​​le jéjunum et l'iléon (Fig. 5a et Extended Data Fig. 5b, c). Par exemple, les concentrations de l'allantoïne, produit final du métabolisme des purines, ont augmenté dans tout l'intestin grêle des souris SPF, atteignant un maximum dans l'iléon, alors que les niveaux sont restés faibles chez les souris sans germes (Fig. 5b). De manière constante, les concentrations des métabolites alimentaires des purines guanine, guanosine et hypoxanthine étaient plus faibles chez les souris SPF que chez les souris sans germes (Fig. 5c), ce qui prouve leur dégradation microbienne et leur conversion ultérieure en allantoïne. Un profil différent a été observé pour la créatine, dont la concentration a initialement augmenté dans le mucus des souris SPF et sans germes, mais a chuté à la ligne de base chez les souris sans germes tout en atteignant un maximum dans le jéjunum des souris SPF (Fig. 5d). L'augmentation initiale de la concentration coïncidente était peut-être due à sa présence dans l'alimentation, mais le schéma différentiel dans le jéjunum indiquait soit une production microbienne, soit une altération microbienne de la consommation de créatine par les cellules intestinales35. Les huit autres métabolites avec des concentrations maximales plus élevées chez les souris SPF comprenaient plusieurs composés liés au métabolisme des acides aminés ou des nucléotides. Un exemple est l'indoleacétylglycine aromatique dérivée de l'indole, dont la concentration a fluctué dans l'intestin grêle SPF, mais était inférieure à la limite de détection dans l'intestin grêle distal de souris sans germes (Extended Data Fig. 5b), ce qui suggère fortement une influence microbienne. . Les concentrations constamment plus élevées dans l'intestin grêle de cytidine 5-monophosphate, d'uracile et d'histidine s'expliquent mieux comme des métabolites microbiens intracellulaires. En plus des 24 métabolites du gros intestin, nous mettons ainsi en évidence l'origine microbienne de 11 métabolites de l'intestin grêle.

a, représentation Heatmap des métabolites avec des concentrations au moins quatre fois plus élevées chez les souris mâles SPF que chez les souris mâles sans germes, en particulier à un endroit de l'intestin grêle par rapport à l'ensemble de l'intestin grêle. La colonne de gauche montre les changements moyens de pli transformés en log2 des dix sites de l'intestin grêle (SPF par rapport à sans germe), et les trois colonnes suivantes décrivent les changements de pli moyens (SPF par rapport à sans germe) dans le duodénum, ​​le jéjunum ou l'iléon séparément . A partir de profils spatiaux (comme sur la Fig. 3, pas tous représentés ici), nous avons identifié la région (duodénum, ​​jéjunum ou iléon) qui varie de sa région voisine. Pour cette région, marquée par un astérisque, nous suspectons une implication microbienne à l'origine de la différence nette, et par conséquent également un SPF plus élevé que la concentration sans germes. b, profils spatiaux des concentrations d'allantoïne dans le SPF et le contenu luminal exempt de germes. Les lignes avec une zone ombrée indiquent la moyenne mobile de la moyenne ± sem des mesures de concentration de cinq souris mâles. c, Concentrations de guanine, de guanosine et d'hypoxanthine dans l'intestin grêle dans le SPF et le contenu luminal et le mucus exempts de germes. Les barres pleines montrent la concentration moyenne des mesures de cinq souris mâles, sur dix petits sites intestinaux. Les 50 points de données correspondants sont affichés sous forme de cercles. d, profils spatiaux des concentrations de créatine dans le SPF et le mucus sans germes. Les lignes avec une zone ombrée indiquent la moyenne mobile de la moyenne ± sem des mesures de concentration avec cinq souris mâles. Abréviations : FC, changement de pli ; GF, exempt de germes ; contre, contre; STO, estomac ; duo, duodénum ; jej, jéjunum ; ile, iléon ; cec, caecum ; col, côlon ; cont – contenu luminal ; muc – mucus; NaN, pas un nombre (les changements de pli n'ont pas pu être calculés).

Données source

Pour déterminer si les modèles de métabolome étaient associés à la composition du microbiome, nous avons profilé le contenu luminal et la composition de la communauté de mucus à l'aide du séquençage de l'ARN ribosomique 16S du duodénum, ​​du jéjunum, de l'iléon, du caecum et du côlon de cinq souris SPF mâles cohébergées de la même portée. Dans les cinq sites, la communauté était dominée au niveau du phylum par les Firmicutes et au niveau de la famille par les Lachnospiraceae, les Oscillospiraceae, les Lactobacillaceae et les Bacteroidaceae (Extended Data Fig. 6a). Comme prévu7, l'abondance relative des Bacteroidales a augmenté dans le gros intestin, en particulier dans les échantillons de lumière, coïncidant avec des concentrations élevées d'acides gras à chaîne courte et d'acides biliaires secondaires. Conformément aux modèles de métabolome, la composition de la communauté était largement invariante dans les trois sites de l'intestin grêle. Les principales différences entre le contenu luminal et le mucus en ce qui concerne la composition étaient une diversité généralement plus grande et l'abondance relative d'Akkermansiaceae dans le contenu luminal (données étendues Fig. 6a). Ces différences étaient les plus prononcées dans le jéjunum, où jusqu'à 20% de l'ensemble de la communauté de contenu étaient des Akkermansiaceae.

Pour évaluer la contribution des micro-organismes au métabolome intestinal mesuré, nous avons déterminé le potentiel fonctionnel du microbiome à l'aide de l'outil PICRUSt238 qui prédit le pool enzymatique de chaque micro-organisme détecté. En comparant l'ensemble obtenu de toutes les réactions microbiennes potentielles avec l'ensemble connu de réactions métaboliques chez la souris de la base de données de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG), les métabolites ont été classés comme potentiellement liés à l'hôte (7), le microbiome (13) ou les deux (81) (Fig. 6a). Par exemple, les concentrations élevées de spermine et d'hydrocinnamate chez les souris SPF s'expliquent mieux par l'origine de l'hôte et du microbiome, respectivement. Pour identifier les espèces productrices, nous avons corrélé les abondances de métabolites et de micro-organismes dans l'espace le long de l'intestin SPF. Dans l'ensemble, les coefficients de corrélation présentaient une distribution normale, avec 620 paires métabolite-microbe présentant une cooccurrence significative (P <0, 01) (Fig. 6b). Pour affiner les prédictions de la production microbienne potentielle, nous n'avons considéré que les métabolites qui étaient plus abondants chez les souris SPF que les souris sans germes (variation > 2). Sur la base des réactions métaboliques microbiennes prédites ci-dessus, nous avons en outre limité notre analyse aux paires dans lesquelles les micro-organismes prédits possèdent des enzymes qui catalysent les réactions impliquant le métabolite apparié. Au total, nous avons prédit 148 paires de production potentielle de métabolites microbiens à partir de la corrélation de 20 métabolites avec l'abondance de 91 micro-organismes englobant 14 ordres bactériens différents (Fig. 6c et Tableau supplémentaire 10). Comme prévu de par leur nature omniprésente, les intermédiaires métaboliques tels que le n-acétylglutamate et le glycérate, produit de dégradation du fructose, étaient liés à 41 et 22 micro-organismes, respectivement. Dix métabolites étaient plus spécifiquement liés à trois micro-organismes ou moins, y compris un seul lien de micro-organisme pour le butyrate, le chénodésoxycholate, le rhamnose et le succinate. Pour le butyrate et le chénodésoxycholate, qui sont les métabolites avec le SPF le plus élevé par rapport au changement de pli sans germe, nous avons identifié un groupe non classé du producteur connu d'acides gras à chaîne courte Lachnospiraceae39 et des membres du groupe Lachnospiraceae NK4A136 comme micro-organismes responsables, respectivement (Fig. .6d). Ces cooccurrences spatiales et d'autres observées de métabolites avec des micro-organismes spécifiques renforcent encore notre lien hypothétique avec l'activité microbienne.

a, diagramme de Venn montrant le chevauchement de 128 métabolites mesurés classés comme liés à l'hôte ou au micro-organisme, sur la base des prédictions PICRUSt2 des fonctions métaboliques microbiennes et du réseau métabolique de la souris. La majorité des métabolites ne peuvent être classés comme associés à l'hôte ou au microbe, sept métabolites sont liés à l'hôte et treize métabolites sont liés à un micro-organisme. Vingt-sept métabolites ne correspondaient à aucun des réseaux métaboliques. b, Distribution des coefficients de corrélation de 126 336 paires métabolite-microbe. Les barres agrandies montrent comment l'application de seuils sur la valeur P, le changement de pli sans germe SPF et la présence d'enzymes métaboliques réduisent le nombre de paires métabolite-microbe fonctionnelles prédites à 148. c, diagramme de Sankey montrant les liens entre les métabolites uniques et les ordres microbiens correspondants dans les paires métabolite-microbe positivement corrélées qui répondent aux seuils définis en b. Les métabolites sont codés par couleur selon MetaCyc. La taille de la ligne de liaison indique le nombre de paires. d, Profils spatiaux des concentrations de métabolites et des micro-organismes associés dans les échantillons de lumen SPF. Les lignes avec une zone ombrée indiquent la moyenne ± sem des mesures de concentration avec cinq souris mâles, et la moyenne ± sem de l'abondance relative des micro-organismes. Abréviations : duo, duodénum ; jej, jéjunum ; ile, iléon ; cec, caecum et col, côlon.

Données source

Nous rapportons une carte anatomiquement résolue du métabolisme intestinal chez des souris mâles en bonne santé SPF et sans germes, révélant le contenu luminal et le mucus de l'intestin grêle et du gros intestin sous la forme de quatre niches métaboliquement distinctes. Le métabolome de l'intestin grêle était dominé par les acides aminés et le gros intestin était caractérisé par des concentrations élevées de produits de fermentation, de vitamines et de composés dans le métabolisme des nucléotides, ce qui correspond à la densité beaucoup plus élevée de micro-organismes dans le gros intestin4. Conformément à ses caractéristiques physicochimiques et immunologiques8,40, la couche de mucus externe densément peuplée tapissant l'intestin était également métaboliquement distincte, les polyamines et la créatine dérivées de micro-organismes étant les caractéristiques les plus distinctives. La créatine et les polyamines telles que la spermidine sont connues pour jouer un rôle clé dans le maintien d'une couche de mucus saine, en particulier en présence d'un microbiote35,41,42. Des concentrations excessivement élevées d'acides aminés protéinogènes distinguaient la fine couche de mucus dans l'intestin grêle de la couche plus épaisse dans le gros intestin4, peut-être une conséquence de la diffusion à partir du contenu luminal ou de la dégradation des protéines à médiation enzymatique.

En plus de caractériser les quatre principales niches intestinales, notre ensemble de données a résolu le schéma spatial de 42 métabolites dans l'intestin grêle, une partie du tractus intestinal qui est intrinsèquement difficile d'accès18 et où les micro-organismes produisent de nombreux composés bioactifs19. Des concentrations élevées de fructose et d'autres monosaccharides dans le duodénum, ​​en aval de l'estomac, résultent probablement de la dégradation des composants de l'alimentation qui ont ensuite été absorbés par l'hôte14,25,43. Vers la fin de l'intestin grêle, nous avons trouvé des preuves de la conversion microbienne des métabolites puriques conduisant à des concentrations élevées d'allantoïne dans le contenu iléal. De même, des concentrations fluctuantes élevées de dérivés indoliques tels que l'indoleacétylglycine dans l'intestin grêle de souris SPF ont suggéré une origine microbienne, qui a jusqu'à présent été décrite principalement dans le gros intestin44. Le métabolisme microbien de l'indole est important car les indoles régulent la libération d'hormones intestinales qui contrôlent la digestion de l'hôte45. Les dérivés d'indole signalent également comme agonistes via le récepteur d'hydrocarbure aryle qui régule l'intégrité de la barrière épithéliale, limitant ainsi l'inflammation intestinale6,46. Nos données de métabolome à haute résolution fournissent ainsi des informations sur la dynamique métabolique associée aux micro-organismes dans les sous-régions de l'intestin grêle, ajoutant ainsi des informations fonctionnelles aux ressources établies telles que les données transcriptionnelles du projet Tabula Sapiens47 et d'autres études approfondies7. Notre variabilité métabolique est généralement cohérente avec les fluctuations de microbiome rapportées entre différents sites d'échantillonnage dans les sous-régions intestinales, bien que les données sur les métabolites fonctionnels semblent varier beaucoup moins que la composition microbienne, ce qui s'explique probablement par la redondance fonctionnelle du microbiome intestinal48.

Sur la base de la concentration plus élevée chez les souris SPF par rapport aux souris sans germes, nous avons fourni des preuves d'une origine microbienne pour 11 et 24 métabolites dans l'intestin grêle et le gros intestin, respectivement. De plus, en prédisant le potentiel métabolique du microbiome et en effectuant des analyses spatiales de cooccurrence, nous avons pu identifier des micro-organismes spécifiques en tant que producteurs potentiels de 20 métabolites. Bien que la niche métabolique de l'intestin grêle soit principalement déterminée par le régime alimentaire et les activités digestives de l'hôte16, nous avons montré que le microbiote intestinal contribue à façonner le métabolome de l'intestin grêle au-delà du métabolisme des lipides et des acides biliaires6,49. Notre carte métabolique anatomiquement résolue nous a permis de déduire certains des processus sous-jacents du modèle de métabolite, tels que des concentrations iléales élevées d'allantoïne qui semblent résulter de la dégradation microbienne des purines, fournissant potentiellement de l'azote dans l'environnement généralement limité en azote de l'intestin50 . L'augmentation continue des concentrations de créatine dans le jéjunum des souris SPF contraste avec les concentrations plus faibles chez les souris sans germes, suggérant soit une production microbienne, une altération de la consommation de créatine par les cellules intestinales hôtes ou une stimulation de la production de créatine dans le foie et les reins28. Les 24 métabolites dérivés du microbiote dans le gros intestin comprennent plusieurs produits microbiens établis tels que les acides gras à chaîne courte butyrate/isobutyrate et isovalérate/valérate, ainsi que les acides biliaires secondaires lithocholate et hyodésoxycholate31,52,53. Plusieurs études ont précédemment rapporté que différents sous-ensembles de ces composés sont très abondants dans les fèces ou le côlon des souris colonisées3,19,30,32,33, mais nous avons récemment identifié l'hydrocinnamate, l'adénosine, le 3-hydroxybutyrate, le caproate et le fucose/rhamnose comme composés de origine métabolique microbienne. Le rhamnose et l'adénosine pourraient être liés à des Clostridia et des Bacilles spécifiques qui contiennent des enzymes nécessaires à leur formation. Les micro-organismes co-occurrents sont des producteurs potentiels des trois autres nouveaux composés, mais de telles corrélations peuvent également résulter indirectement de la croissance microbienne sur des métabolites nourris de manière croisée. En revanche, l'hydrocinnamate (également connu sous le nom de 3-phényl-propionate) ne peut pas être produit par les cellules eucaryotes. Ainsi, la concentration 259 fois plus élevée dans le gros intestin des souris SPF par rapport aux souris sans germes résulte vraisemblablement de la conversion de la phénylalanine et de la tyrosine par Clostridia13, qui coïncide avec des abondances de clostridium dans le gros intestin qui représentent environ la moitié de l'ensemble. Microbiote SPF4,13,29. Le corps cétonique 3-hydroxybutyrate est un métabolite hôte avec une production primaire dans le foie, mais c'est aussi un produit potentiel de divers Clostridia identifiés dans nos données 16S. Sa concentration dix fois plus élevée dans le gros intestin des souris SPF pourrait ainsi être due à la sécrétion microbienne, à l'induction microbienne de la production de 3-hydroxybutyrate par l'hôte ou à une combinaison des deux, dont la clarification nécessiterait de nouvelles expérimentations.

À notre connaissance, nous fournissons ici la première carte anatomique in vivo du métabolisme non perturbé de la lumière et du mucus le long de l'ensemble de l'intestin de la souris. Nous consolidons ainsi également les résultats d'études antérieures portant sur des interventions diététiques, des modèles de maladies ou des sites intestinaux spécifiques. La comparaison des paysages métaboliques chez les mâles colonisés SPF par rapport aux souris sans germes nous a permis de démêler l'origine de nombreux métabolites dans différentes niches et, dans certains cas, de déduire les processus sous-jacents. Ces associations sont encore renforcées par une analyse de corrélation mettant en évidence des associations spécifiques métabolite-microbe. Bien que nous manquions de comparaison avec les matières fécales, sur la base de ces différences métaboliques et des différences rapportées dans le microbiote7,16, nous concluons que l'intestin est un environnement beaucoup trop variable pour être approximé à l'aide d'échantillons fécaux uniquement, comme démontré pour les souris mono-colonisées54. Notre ensemble de données fournit également un point de départ pour de futures études sur le métabolisme intestinal.

Toutes les expériences de souris ont été réalisées conformément aux réglementations fédérales et cantonales suisses. L'autorisation a été accordée par la commission pour l'expérimentation animale du canton de Berne. Des souris mâles C57BL/6J ont été élevées et maintenues au Clean Mouse Facility, Université de Berne, Suisse. Des souris SPF mâles colonisées sur fond C57BL/6J ont été achetées chez Envigo. Des souris mâles exemptes de germes C57BL/6J ont été obtenues par césarienne et maintenues dans un élevage aseptique dans des isolateurs à film souple. Cinq animaux répétés ont été utilisés par groupe. Toutes les souris étaient âgées de 10 à 14 semaines, confirmées exemptes d'agents pathogènes et maintenues sous un cycle de lumière de 14 h/obscurité de 10 h à une température moyenne de 20 °C et 40 % d'humidité. Toutes les souris ont reçu un régime de laboratoire standard Kliba Nafag 3436 chow et de l'eau ad libitum. Les souris ont été tuées par dislocation cervicale à la même heure de la journée pour contrôler les variations dues au rythme circadien après 4h de jeûne, ce qui permet de compléter le transit dans l'intestin grêle55. Le régime alimentaire résiduel sera dans le caecum et les souris répliquées sont donc plus comparables. Des échantillons du contenu luminal et du mucus intestinal ont été prélevés sur 15 sites le long de l'intestin, comme décrit précédemment8. En bref, l'ensemble du tractus gastro-intestinal a été réséqué via une incision abdominale. Les différentes régions intestinales (estomac, intestin grêle, caecum et côlon) ont été séparées, ouvertes longitudinalement, le contenu luminal a été retiré et le mucus a été gratté des parois intestinales. Les échantillons ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide.

Les métabolites ont été extraits de 50 mg d'échantillon dans 20 volumes par poids d'eau Millipore à 80 °C. Les échantillons ont été vortexés pendant 10 s, incubés pendant 3 min à 80 °C dans un Eppendorf Thermomixer à vitesse maximale (1 500 tr/min), vortexés pendant 10 s et centrifugés pendant 3 min à 20 000 g à température ambiante. Du surnageant, 150 µl ont été transférés dans des plaques de microtitration à 96 puits et stockés à -80 °C. Pour l'analyse par spectrométrie de masse, les échantillons ont été dilués 1:1 dans une phase mobile (méthanol/eau/acide acétique 49,6:49,6:0,8 v/v/v) contenant le composé de référence de temps de rétention acide 9-anthracène carboxylique (Sigma-Aldrich) et conservé à -20 °C jusqu'à l'analyse. Pour les extractions de métabolites à partir de granulés alimentaires, trois granulés ont été pesés et dissous dans 20 ml d'eau Millipore pendant une nuit à température ambiante. Le lendemain, 10 ml d'eau Millipore ont été ajoutés et vortexés pendant 10 s. Un millilitre de suspension de granulés alimentaires a été chauffé à 80 °C et les métabolites ont été extraits comme décrit ci-dessus (incubation de 3 min à 80 °C dans un Eppendorf Thermomixer à vitesse maximale (1 500 tr/min), vortexés pendant 10 s et centrifugés pendant 3 min à 20 000 g à température ambiante). Du surnageant, 150 µl ont été transférés dans des plaques de microtitration à 96 puits et stockés à -80 ° C jusqu'à l'analyse. Avant les mesures, les échantillons ont été dilués au 1:20 dans de l'eau MilliQ.

Le méthanol et l'isopropanol de qualité HPLC, tous les produits chimiques, les additifs tampons pour le référencement de masse en ligne et les produits chimiques de préparation d'échantillons ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich, Agilent Technologies et Cayman Chemicals. L'eau de qualité HPLC a été obtenue à l'aide d'un système de purification d'eau IQ7000 MilliQ équipé d'un LC-Pak (Merck).

Les échantillons ont été analysés sur un système LC Agilent 1290 Infinity couplé à un spectromètre de masse Q-TOF de masse précise Agilent 6550 à l'aide de l'ionisation par électrospray à double jet Agilent (Agilent Technologies). Le volume d'injection était de 4 µl et la séparation chromatographique a été réalisée à l'aide d'une colonne Zorbax SB-Aq 1,8 µM 2,1 × 50 mm avec une colonne de garde Zorbax SB-C8 et une cartouche à résolution rapide (2,1 × 30 mm 3,5 µm). L'élution a été réalisée en utilisant un gradient linéaire à un débit de 0,6 ml min-1 en commençant par une phase mobile B à 2 % (0,2 % v/v d'acide acétique dans du méthanol) passant progressivement à 98 % d'éluant B en 13 min. Ceci est suivi d'un flux isocratique de 1,5 min de phase mobile A à 2 % (0,2 % v/v d'acide acétique dans de l'eau MilliQ) et d'un équilibrage de 1 min à 2 % d'éluant B. L'acquisition des données a été réalisée à l'aide d'une ionisation par électrospray dans le positif et mode négatif utilisant une analyse à balayage complet sur une plage de masse de m/z 50 à m/z 1 700 en mode d'acquisition à plage dynamique étendue de 2 GHz. Pour la correction de l'axe de masse en ligne, de la purine et de l'hexakis (1H,1H,3H-tétrafluoropropoxy)phosphazine (HP-0921 ; Agilent Technologies) ont été ajoutés à la phase mobile. Les réglages d'électrospray étaient les suivants : tension de pulvérisation ionique, mode négatif 3,5 kV et mode positif 4 kV ; température capillaire, 325 °C ; débit de gaz de séchage, 10 l min−1 ; et une pression de nébuliseur de 45 psi.

Des mesures métabolomiques non ciblées ont été effectuées à l'aide de FIA-TOF-MS avec une configuration composée d'une pompe LC Agilent série 1100 couplée à un échantillonneur automatique Gerstel MPS2 et d'un spectromètre de masse Q-TOF de masse précise Agilent 6550 à l'aide d'une double ionisation par électrospray Agilent Jet Stream (Agilent Technologies) , fonctionnant en mode d'ionisation négative. Le débit était de 150 µl min-1 de phase mobile constituée d'isopropanol/eau MilliQ (60:40 v/v) tamponnée avec du fluorure d'ammonium 1 mM. De plus, 1 mM d'acide 3-amino-1-propanesulfonique et 1 µM d'hexakis phosphazine (HP-0921; Agilent Technologies) ont été ajoutés à la phase mobile en tant que composés d'étalonnage de l'axe de masse en ligne. Le volume d'injection était de 5 µl, les mesures ont été réalisées de manière randomisée et en double injection. Les spectres de masse ont été enregistrés de m/z 50 à m/z 1 700 avec une fréquence de 1,4 spectres par s pendant 0,48 min en utilisant des paramètres haute résolution de 4 GHz. Les réglages d'électrospray étaient les suivants : tension de pulvérisation ionique, mode négatif 3,5 kV ; température capillaire, 325 ˚C ; débit de gaz de séchage, 5 l min−1 ; et une pression de nébuliseur de 30 psi. Les tensions du fragmenteur, du skimmer et de l'octopole ont été respectivement fixées à 175, 65 et 750 V.

Des solutions mères de 138 composés uniques purifiés obtenus auprès de Sigma-Aldrich ont été préparées en les dissolvant séparément dans de l'eau MilliQ, des mélanges éthanol-eau ou méthanol-eau, ou du diméthylsulfoxyde, puis mélangées à 600 µM (pour une liste complète de toutes les normes, voir Supplémentaire Tableau 1). Le mélange a été aliquoté et séché à 0,12 mbar jusqu'à siccité complète dans une configuration SpeedVac (Christ) et stocké à -80 ° C. Les solutions de travail ont été préparées dans de l'eau MilliQ avec 0,4 % (v/v) d'acide acétique et filtrées avant utilisation.

Les courbes d'étalonnage ont été obtenues à partir d'une série de dilutions en série de 24 points couvrant sept ordres de grandeur (de 17,9 pM à 150 µM) dans de l'eau MilliQ et, pour évaluer les effets de matrice, dans un échantillon de fond d'étude regroupé. Pour cela, la matrice diluée a été dopée avec le mélange standard dilué en série. Les étalons ont été mesurés au début et à la fin de la mesure en mode d'ionisation positive et négative.

Une régression linéaire des comptages d'ions transformés en log par rapport aux concentrations transformées en log a été effectuée sur les mesures de la série de dilution standard, permettant la suppression itérative de jusqu'à six étapes de dilution de la limite de concentration supérieure et de 12 points de données des dilutions inférieures, avec le objectif de maximiser la valeur R2. La limite inférieure de quantification et la limite supérieure de linéarité ont été déterminées comme les étapes de dilution acceptées les plus basses et les plus élevées, respectivement. Les concentrations de métabolites ont ensuite été calculées sur la base des pentes et des intersections dérivées. Seules les valeurs comprises dans la plage linéaire ont été prises en compte pour les analyses ultérieures. Sur 138 métabolites, 128 ont pu être détectés et quantifiés de manière fiable sur la base de ces critères. Pour chaque métabolite unique, nous avons mesuré jusqu'à cinq modifications différentes (anion déprotoné, cation protoné, cation d'adduit de sodium, cation dimère et cation d'adduit dimère de sodium) et avons sélectionné manuellement la modification en fonction de l'ajustement linéaire (valeur R2 la plus élevée), de la plage linéaire et de la fiabilité. couverture dans l'ensemble de données (nombre maximal d'échantillons détectés). Les modifications sélectionnées, les ajustements linéaires des normes respectives et l'ensemble de données final peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 1. Les concentrations de métabolites sont rapportées comme \(\frac{{\mathrm{{nmol}}}}{{\mathrm{{mg }}\;{\mathrm{échantillon}}}}\).

Pour les données LC – TOF – MS, le prétraitement, la sélection des pics et l'annotation ont été effectués à l'aide du logiciel MassHunter Quantitative Analysis B.07.00 (Agilent Technologies). Les métabolites ont été classés selon MetaCyc56 (https://metacyc.org/). Une analyse plus poussée des données, des statistiques et une visualisation ont été effectuées après l'exportation des données brutes dans MATLAB R2021b (MathWorks) à l'aide de fonctions intégrées dans les boîtes à outils bioinformatiques et statistiques. Les graphiques, illustrations et tracés ont été finalisés à l'aide d'Illustrator (Adobe).

Pour cinq souris SPF, nous avons échantillonné séparément le mucus et le contenu luminal sur cinq sites : duodénum, ​​jéjunum, iléon, caecum et côlon. Suite à l'extraction de l'ADN selon les instructions du fabricant (QIAamp PowerFecal DNA Kit, Qiagen), des amplicons couvrant la région variable 3 et 4 du gène de l'ARNr 16S ont été préparés à l'aide des amorces dégénérées 515FY et 806R selon les protocoles de référence pour le projet Earth Microbiome57,58,59 . Les amplicons amplifiés par PCR ont été purifiés sur gel (Kit d'extraction de gel MinElute, Qiagen), et des adaptateurs de séquençage et des codes-barres Illumina ont été ajoutés, suivis d'un nettoyage à base de billes (billes AMPure, Beckman Coulter). Les échantillons ont été séquencés à l'aide d'un Illumina MiSeq au Functional Genomics Center de Zurich. Un total de 16 557 915 lectures de séquençage à partir de 72 échantillons (médiane = 173 616) ont servi d'entrée pour l'inférence des variants de séquence d'amplicon (ASV) à l'aide de dada2 v.1.14 (réf. 60). Les séquences d'amorces (515FY = GTGYCAGCMGCCGCGGTAA, 806R = GGACTACNVGGGTWTCTAAT) ont été supprimées à l'aide de cutadapt v.2.8 (réf. 61) et seuls les inserts contenant les deux amorces et d'au moins 75 bases de long ont été conservés pour l'analyse en aval. Ensuite, la qualité des lectures a été filtrée à l'aide de la fonction filterAndTrim du package dada2 R (maxEE = 2, truncQ = 3, trimRight = (40, 40)). Les fonctions learnErrors et dada ont été utilisées pour calculer l'inférence d'échantillon en utilisant pool = pseudo comme paramètre. Les lectures ont été fusionnées à l'aide de la fonction mergePairs et les bimères ont été supprimés avec la fonction removeBimeraDenovo (method = pooled). Les ASV restants ont ensuite été annotés de manière taxonomique à l'aide du classificateur IDTAXA62 en combinaison avec la base de données Silva v.13863 disponible sur http://www2.decipher.codes/Downloads.html. Les échantillons avec moins de 1 000 lectures (neuf échantillons au total) n'ont pas été pris en compte pour les analyses en aval. Le tableau d'abondance ASV résultant a été sous-échantillonné à une profondeur de séquençage commune (6 000 lectures par échantillon, c'est-à-dire le minimum des 63 échantillons restants) pour corriger les différences de profondeur de séquençage entre les échantillons à l'aide de la fonction rrarefy du package vegan R. Les tables d'abondance à chaque niveau taxonomique ont été calculées en additionnant l'abondance des ASV appartenant aux mêmes taxons.

Des analyses statistiques ont été effectuées dans MATLAB R2021b (MathWorks) à l'aide de fonctions intégrées dans les boîtes à outils bioinformatiques et statistiques. Les valeurs entre deux groupes (par exemple, entre différents sites d'échantillonnage) ont été comparées et les significations statistiques ont été calculées à l'aide des tests t de Student pour échantillons appariés (implémentés dans la boîte à outils MATLAB Statistics). Généralement, cinq souris mâles ont servi de répliques biologiques. Les expériences n'ont pas été répétées. Le nombre exact d'échantillons utilisés pour calculer une différence statistique est indiqué dans la légende de chaque figure. Le taux de fausses découvertes a été contrôlé en corrigeant les valeurs P calculées pour les tests multiples (procédure de Benjamin-Hochberg), et les valeurs P corrigées ≤ 0, 05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Pour prédire les abondances fonctionnelles dans le microbiome, PICRUSt2 v.2.5.1 (réf. 38) a été utilisé sur les ASV analysés (tableau supplémentaire 10), ce qui a donné une liste de numéros de classification enzymatique pour chaque micro-organisme détecté. Le réseau métabolique prédit du microbiome a ensuite été reconstruit à partir des listes de classification des enzymes et comparé au réseau métabolique de Mus musculus dans KEGG à l'aide du package python bioservices64. Les métabolites mesurés ont été cartographiés sur l'un ou l'autre réseau pour prédire leur origine. Les corrélations spatiales sur tous les sites d'échantillonnage entre les micro-organismes et les métabolites ont été calculées pour chaque paire sous forme de coefficient de Spearman à l'aide du package python Scipy v.1.9.3 (réf. 65).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données brutes LC-TOF-MS ont été déposées chez MassIVE et sont disponibles avec le code d'accession MSV000091478 (https://doi.org/10.25345/C5K06XB0Q). Les données de séquençage de l'ARNr 16S sont disponibles sous l'ID BioProject PRJNA944604 dans les archives de lecture de séquences NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA944604). La base de données KEGG a été utilisée comme ressource dans les associations métabolite-microbe. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions GS Guiral pour son aide dans le traitement des données de séquençage et la fourniture d'informations spécifiques à la méthode. Nous remercions A. Othman et K. Ortmayr pour leur aide et leur soutien lors de la mise en place du flux de travail métabolomique. Le financement partiel par l'Institut national de la santé RO1 (GM117324) aux États-Unis, le Fonds national suisse de la recherche scientifique (SNSF Sinergia CRSII5_177164) aux États-Unis et à l'AJM, et le programme ETH Fellows (ETH Zurich Foundation) à JT est reconnu.

Financement en libre accès fourni par l'Institut fédéral suisse de technologie de Zurich.

Institut de biologie des systèmes moléculaires, ETH Zürich, Zürich, Suisse

Karin HU Meier, Julian Trouillon, Tobias Führer, Nicola Zamboni & Uwe Sauer

Département de chirurgie et de médecine viscérales, Inselspital, Hôpital universitaire de Berne, Université de Berne, Berne, Suisse

Hai Li et Andrew J. Macpherson

Institut de microbiologie, ETH Zürich, Zürich, Suisse

Mélanie Lang et Shinichi Sunagawa

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US et AJM ont conceptualisé le projet. KHUM a mis en place le flux de travail LC-TOF-MS, effectué la métabolomique et la préparation des échantillons de séquençage 16S, y compris l'extraction des métabolites, la préparation de l'ADN génomique et de l'amplicon 16S, les mesures métabolomiques, le traitement des données métabolomiques, la métabolomique et l'analyse des données de séquençage, y compris l'écriture de code, et préparé et visualisé toutes les données de métabolomique et de séquençage. JT a effectué une analyse de cooccurrence métabolite-microbe. HL a réalisé des expériences sur des souris, avec l'aide de KHUMML, a traité des données de séquençage brutes et a fourni un support d'analyse. TF et NZ ont fourni un soutien et des conseils dans la planification du projet, les mesures et les commentaires sur le manuscrit. SS et AJM ont fourni des commentaires sur le manuscrit. KHUM et US ont écrit le manuscrit.

Correspondance avec Uwe Sauer.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Metabolism remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : Ashley Castellanos-Jankiewicz, en collaboration avec l'équipe Nature Metabolism.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a - Schéma présentant les 15 sites de prélèvement utilisés dans cette étude : un site dans l'estomac, 10 sites dans l'intestin grêle (trois dans le duodénum, ​​quatre dans le jéjunum et trois dans l'iléon), et quatre sites dans le gros intestin ( dans le caecum et dans le côlon ascendant, transverse et descendant). b - Répartition des classes chimiques MetaCyc parmi l'ensemble des 128 métabolites mesurés avec notre méthode LC-TOF-MS utilisée dans cette étude (Tableau complémentaire ST1). c - Analyse de regroupement hiérarchique des abondances de métabolites du mucus intestinal de souris SPF mâles. Les abondances pour les 128 métabolites quantifiés sont présentées sous forme de scores z des concentrations normalisées moyennées à partir de cinq souris, sur les 15 sites d'échantillonnage. Le regroupement a été effectué sur la base des distances euclidiennes sur des échantillons luminaux (Fig. 1a) et a abouti à l'identification de trois groupes principaux, correspondant aux trois principales régions physiologiques connues du tube digestif, à savoir l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin. Dans cette carte thermique ici, les métabolites le long de l'axe y sont triés selon l'ordre de la Fig. 1a, à des fins de comparaison. Les métabolites des trois groupes principaux sont codés par couleur selon MetaCyc (comme dans S1b ; tableau supplémentaire ST1). d - Concentrations de métabolites d'arginine, d'ornithine et de spermidine dans le contenu luminal SPF et les échantillons de mucus du gros intestin. Les tracés représentent 20 points de données (quatre sites du gros intestin, cinq souris mâles), les boîtes à moustaches montrent la concentration médiane de métabolites avec une marque plus épaisse, les 25e et 75e centiles sont indiqués par la boîte et les moustaches s'étendent aux points de données les plus extrêmes non considérés comme des valeurs aberrantes.

Données source

a, b - Analyse de regroupement hiérarchique des abondances de métabolites à partir de 10 échantillons de contenu luminal de l'intestin grêle (a) et de mucus (b) de souris SPF mâles. Les abondances de 128 métabolites sont présentées sous forme de scores z des concentrations normalisées moyennes de cinq souris mâles et de trois échantillons de duodénum, ​​quatre de jéjunum ou trois d'iléon, respectivement. Un regroupement hiérarchique a été effectué sur la base de ces trois valeurs moyennes (duodénum, ​​jéjunum, iléon). Les métabolites qui changent de manière significative sont indiqués par des cases et des astérisques (valeur de p ≤ 0,05). Les valeurs de p ont été calculées à l'aide d'un test t de Student à échantillon apparié bilatéral et peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire ST4. La clé de couleur de la carte thermique indique une abondance relative faible à élevée de métabolites dans tout l'intestin grêle. c – Distribution des pics de concentration en contenu luminal (en haut) et en mucus (en bas) de l'intestin grêle, par rapport aux trois régions. Trois barres indiquent les trois régions du duodénum, ​​du jéjunum et de l'iléon, l'axe y montre la fréquence des concentrations maximales de métabolites se produisant dans la région respective. Abréviations : duo – duodénum, ​​jej – jéjunum et ile – iléon.

Données source

a, b - Analyse de regroupement hiérarchique des abondances de métabolites à partir de quatre échantillons de contenu luminal intestinal (a) et de mucus (b) chez des souris SPF mâles. Les abondances de 128 métabolites sont présentées sous forme de scores z des concentrations normalisées moyennes de cinq souris mâles par site d'échantillonnage dans le côlon (caecum, côlon ascendant, transverse et descendant). Le regroupement hiérarchique a été effectué uniquement sur ces quatre valeurs. Les métabolites qui changent de manière significative sont indiqués par des cases et des astérisques (valeur de p ≤ 0,05). Les valeurs de p ont été calculées à l'aide d'un test t de Student à deux échantillons appariés. La clé de couleur de la carte thermique indique une abondance relative faible à élevée de métabolites dans le gros intestin. c - La distribution des concentrations maximales dans le contenu luminal (en haut) et le mucus (en bas) du gros intestin, par rapport aux quatre régions est représentée. Quatre barres indiquent les régions, l'axe y montre la fréquence des concentrations maximales de métabolites se produisant dans la région respective. Abréviations : cec – caecum, acol – côlon ascendant, tcol – côlon transverse et dcol – côlon descendant.

Données source

a - Distribution des changements de concentration de métabolites dans le SPF par rapport à la comparaison sans germe dans le contenu luminal et les échantillons de mucus. Les changements de pli sont calculés par métabolite dans l'habitat respectif pour cinq souris mâles et 15 sites d'échantillonnage, log2 transformés, et leur distribution est affichée sous forme de tracé de contour le long de l'axe des x. La fréquence est notée sur l'axe des ordonnées. Un changement de facteur log2 négatif indique une concentration de métabolite plus élevée chez les souris sans germes, un changement de facteur log2 positif indique une concentration plus élevée chez les souris SPF mâles. En gris, tous les changements de pli absolus ≤ 2 sont marqués. b - Grande concentration intestinale d'adénosine, de 3-hydroxybutyrate, de fucose/rhamnose et de caproate dans le SPF et le contenu luminal et le mucus exempts de germes. Les barres pleines montrent la concentration moyenne des mesures de cinq souris mâles, en moyenne sur les quatre gros sites intestinaux. Les 20 points de données correspondants sont affichés sous forme de cercles. Abréviations : FC – changement de pli ; GF – sans germes ; duo – duodénum, ​​jej – jéjunum et ile – iléon ; cont – contenu luminal ; muc - mucus.

Données source

a - Changements de pli transformés Log2 de la concentration moyenne dans l'intestin grêle de 42 métabolites avec des modèles longitudinaux dans l'intestin grêle (voir Fig. 3 pour des exemples de profils, Fig. 5, Tableau supplémentaire ST4). Les changements de pli ont été calculés entre les échantillons mâles SPF et mâles exempts de germes dans le contenu luminal (panneau de gauche) et le mucus (panneau de droite), en moyenne sur les 10 sites d'échantillonnage et cinq répétitions biologiques. Les boîtes à moustaches sont donc basées sur 50 points de données, où le changement de pli log2 médian est indiqué en bleu, les 25e et 75e centiles sont indiqués par la boîte, les moustaches s'étendent aux points de données les plus extrêmes non considérés comme des valeurs aberrantes, et les valeurs aberrantes sont marquées du symbole plus . La zone grise représente les changements absolus log2 fois ≤ 2. b - Profils spatiaux des métabolites du contenu luminal ou des concentrations de mucus chez les souris SPF et sans germes. Les lignes avec une zone ombrée indiquent la moyenne mobile de la moyenne ± sem des mesures de concentration avec cinq souris mâles. Abréviations : FC – changement de pli ; GF – sans germes ; duo – duodénum, ​​jej – jéjunum, ile – iléon, cec – caecum et col – côlon.

Données source

Composition de la communauté et différences dans l'intestin du contenu luminal du SPF masculin (panneau supérieur) et du mucus (panneau inférieur) sur cinq sites : duodénum, ​​jéjunum, iléon, caecum et côlon. Les abondances relatives des microbes sont affichées en pourcentage, au niveau de la famille. Les 95 % des meilleurs membres de la communauté annotés par échantillon sont affichés de manière discrète, les catégories bactériennes représentant moins de 5 % de la communauté sont regroupées dans "autres".

Données source

Tableaux supplémentaires 1 à 10 combinés dans un seul classeur avec dix onglets distincts. Les données comprennent des informations détaillées sur les molécules, les changements de pli spécifiques, les valeurs P et d'autres informations soutenant le texte principal et les figures.

Données de métabolites traitées et quantifiées par échantillon.

Données sur l'abondance des métabolites, scores de l'analyse en composantes principales (PC1 et PC2), données sources statistiques (valeurs P et changements de pli).

Données sources statistiques (valeurs P et changements de facteur), données sur la concentration des métabolites.

Données sur la concentration des métabolites.

Données sources statistiques (valeurs P et changements de facteur), données sur la concentration des métabolites.

Données sources statistiques (valeurs P et changements de facteur), données sur la concentration des métabolites.

Identifiants KEGG, données sources statistiques, données de concentration de métabolites.

Données sur l'abondance des métabolites, données sur la concentration des métabolites.

Données sur la concentration des métabolites.

Données sur la concentration des métabolites.

Données sources statistiques, données sur la concentration des métabolites.

Données sources statistiques (valeurs p et changements de pli), données de concentration de métabolites.

Données sur l'abondance microbienne.

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Réimpressions et autorisations

Meier, KHU, Trouillon, J., Li, H. et al. Le paysage métabolique de l'intestin de la souris mâle identifie différentes niches déterminées par les activités microbiennes. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

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Reçu : 28 juin 2022

Accepté : 06 avril 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

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